不同刺激剂PHA和ConA对绒山羊淋巴细胞有丝分裂中期化的影响.pdf

· 118 · 生理生化 中国畜牧兽医 2014年第 41卷第 1O期 不同刺激剂 PHA和 ConA对绒山羊淋巴细胞 有丝分裂中期化的影响 俎红丽 ，张博伦 ，于梦然 ，蔡婷 ，王琳 ，欧阳效晴 ，刘志红 ，李金泉 (1．内蒙古农业大学动物科学学院，动物遗传育种与繁殖重点实验室，内蒙古呼和浩特 010018； 2．复旦大学生命科学院，上海 200433) 摘要 ：试验 旨在探索使较高 比例 的淋 巴细胞富集在有丝分裂 G2／M 期的最佳条件 。运用植物血凝素 (PHA)和刀豆蛋 白 A(ConA)对淋巴细胞进行刺激使其增殖，培养一定时间后加秋水仙素对淋巴细胞进行同步化处理，用流式细胞仪检测G2／M 期的细胞数量进行 比对 ，观察试剂 的最佳作用浓度和加秋水仙素的最佳时间。结果表 明，采用 PHA和 ConA刺激淋 巴细胞 增殖的最佳作用浓度是 6o和 5ptg／mL，且淋 巴细胞经 ConA刺激培养 45h再加秋水仙素处理 5hG2期的比例最高为 58．38 。结果提示 ，就绒山羊的淋 巴细胞来说 ，ConA刺激绒 山羊淋巴细胞增殖 的效果 比PHA好 ，且摸索出细胞 G2／M期的 时间点至关重要 。 关键词 ：绒山羊；植物血凝素(PHA)；刀豆蛋 白A(ConA)；淋 巴细胞 ；秋水仙素 ；细胞 同步化 ；流式细胞仪 中图分类号 ：Q253 文献标识码 ：A 文章编号 ：1671-7236(2014)1001l8一O5 人外周血液中的小淋巴细胞几乎都处在 Go期 Dolezel等 (2011)报道随着测序技术 的发展 ，使用流 或 G1期，一般情 况 下是不分裂 的 (任莉萍等 ， 式细胞仪分离单条染色体 ，将拓展测序技术应用 的 2O】1)。在人工离体培养条件下，在培养液中加入植 领域 ，对于山羊这种大基 因组动物更有广泛 的应用 物血凝素 (PHA)，则能刺激小淋巴细胞转化为淋巴 价值 。流式细胞术可以分选 出指定 的染色体 ，能快 母细胞而进行有丝分裂。刀豆蛋 白A(ConA)是一 速精确地检测染色体数 目和结构的畸变，以及非整 种凝集剂，在电子显微镜下观察细胞精细结构发现 倍体和染色体缺失。目前 已在 17个植物物种 中利 可使微管数量大量增加 ，从而促进小鼠淋 巴细胞有 用流式细胞术对染色体进行了分析与分选 。流式分 丝分裂 ，秋水仙素可以抑制小 鼠淋巴细胞微管的聚 拣能分离大量的单一类型的染色体，分拣的染色体 合 ，影响小鼠淋巴细胞的DNA和 RNA合成 (Rudd 是构建染色体专性 DNA文库和基因定位 的最好材 等 ，1979)；ConA和琥珀酰化衍生物在最适浓度下 料 ，流式分拣染色体 的一个主要用途是构建染色体 都可极大地促进有丝分裂的进行 ，且效果是相同的， 专性文库 (李立家等，2005)。翟中和 (1992)采用流 当ConA的浓度达到 50ptg／mL时 ，细胞有丝分裂 式分离单条染色体工作的核心在于富集足量同步化 活动逐步降低 (Hadden等 ，1976)。在牙鲆外周血 的中期染色体 的细胞核型 ，因此细胞 同期化的处理 淋 巴细胞培养及染色体制备条件下，ConA和 PHA 是研究中最基础最为重要 的一步。细胞周期时间长 2种刺激源都能促进牙鲆淋 巴细胞的有丝分裂，制 短的主要差别在 G1期 ，而 S期 、G2期和 M 期的总 备 出染色体标本 ，但 以ConA为刺激源可获得更多 时长相对恒定 ，尤其是 M 期持续的时间更为恒定 ， 的染色体分裂相 ，其分裂指数也极显著 (P％0．01) 常常仅持续 0．5h左右。通过添加有丝分裂抑制 高于 PHA刺激源 的作用效果 (朱香萍等 ，2007)。 剂 ，来阻滞细胞 的有丝分裂使其停滞在 G2／M 期 ， 人工调控增加 G2／M期的细胞数量，为单条染色体 收稿 日