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线路二_哺乳动物细胞 本文由80后的网商贡献 pdf文档可能在WAP端浏览体验不佳。建议您优先选择TXT，或下载源文件到本机查看。 线路二：哺乳动物细胞 RNAi 实验：siRNA 的设计，合成 前面说过，哺乳动物细胞导入 30bp 以上的长双链 RNA（dsRNAs）往往会诱发非预期的抗病 毒应答反应， 所以不能用体外合成长的 dsRNA 直接导入细胞。 常见的做法之一是直接制备 19—27bp 左右的 siRNAs，然后再将 siRNAs 转入哺乳动物细胞。 siRNA 的设计是决定 RNAi 实验成败关 键性的第一步。虽然 siRNA 设计法则在不断 地完善，可是并非每个设计出来的 siRNA 一 定能有效沉默目标基因的表达，也没有办法 100％预测设计出来的 siRNA 是否有效， 所以 设计出来的 siRNA 都必须经过实验证实。 直接购买已经证实有效的 siRNAs，好处 是已经厂家荧光定量 RT-PCR 预证有效，无 需设计、合成和验证，无需顾虑 siRNA 是否 有效， 便于研究人员把全部精力集中到目标基 因功能的研究上， 而不需要花费在其他地方— —在全球科学家争分夺秒抢夺基因功能研究 成果和专利的今天， 时间就是金钱， 为什么要 把宝贵的时间和精力浪费在反复琢磨如何设 计和验证 siRNA 上呢？除非你立志成为 siRNA 设计专家。 专业的设计， 高质量的合成和纯化， 往往 只需要很低的浓度就可以达到不错的基因沉 默效果， 也有助于减少脱靶等非预期反应—— 需要特别说明的是大多数 siRNA 不能达到 100%沉默基因表达的效果毕竟不是基因 彻底敲除，只是在转录后水平降解 mRNA， 再加上 siRNA 转染本身很难保证 100%的细胞 被成功转染， 未转染细胞在检测时也会影响结 果以 RNAi 试剂领域两大领先厂家 Ambion 和 Qiagen 为例，他们把能降低目标基因表达 70%以上的 siRNA 称为有效，也有些公司的 标准更高，如 Bio-Rad 标准是减低目标基因 85%的表达，Dharmacon 和 Sigma 标准则是 虽然很多厂家如 Qiagen 等都在持续进行 siRNA 验证工作，以满足更多研究人员的需 求， 但是毕竟预证有效的 siRNA 还是有限的， 如果你的基因并不在此范围内， 你也可以选择 1. 厂家设计定制只要提供基因的信息，即 可由厂家设计合成纯化， 还可以按要求修饰和 75%。siRNA 算是非常高效的，只需很低的浓 度就可沉默基因表达， 达到有效浓度后再增加 也不会提高基因沉默的效果， 反而研究结果表 明过高浓度的 siRNA（超过 100nM 以上）还 有可能导致非预期的脱靶反应。所以在实验 中， 通常就需要摸条件， 以有效的最低浓度为 最适浓度以期减少非特异反应。 因此在购买现成的 siRNA，同样的包装 量， 有效工作浓度不同， 每次使用的成本就不 用，比如 Bio-Rad 的 27bp siRNA 保证工作浓 度是 5nM，Ambion 的保证有效的最高工作浓 度是 30nM，多数厂家是 100nM，如果是荧光 标记的 siRNA 工作浓度通常达到 100nM。假 设同样的量，就算 Bio-Rad 的 27bp siRNA 比 100nM 工作浓度的其他品牌 siRNA 产品贵上 20 倍，二者每次实验使用成本也是一样的！ 因此， 在考虑价格和包装时也要同时留意其有 效工作浓度， 才好比较价格。 当然也需要同时 考虑评估标准是用哪种细胞株。以 Qiagen 的 资料为例，其验证 siRNA 用于 Hela、A549 细胞工作浓度为 5nM 足够，用于 HepG2、 HEK293、MCF-7 细胞则需要用到 25nM。 生物通 第 14 页 ebioTech特刊RNAI 5年回顾及技术宝典 标记。多个厂家提供 NCBI 的 RefSeq 数据库 中已有的人类，大鼠或者小鼠的全部基因的 siRNA 定制合成服务，生物通在后面会介绍。 对同一个基因通常需要设计 3-5 个不同的 siRNA 以保证其中至少 2 个 siRNA 是有效的， 同时可做相互对照。同一基因定制多个 siRNA，相比设计合成单个 siRNA，厂家也会 有“套餐”优惠 2. 自己设计再叫厂家合成如果研究对象 不在此列，也可以采用网上免费的 siRNA 在 线设计工具来设计， 生物通在随后附录一些在 线工具的地址以供参考。 不过， 别指望用不同 的设计工具对同一序列设计一定会得到类似 的结果不同的在线工具有不同的设计法则 和评分标准， 同一序列用不同的在线工具设计 得到的结果也可能各不相同 生物通 ebioTips 6：好的实验设计应该至