M细胞实验中常遇到的困难及克服方法.pdfVIP

506 以科学发展观促进科技创新(下) ——————————————————————————————————————一 M细胞实验中常遇到的困难及克服方法 童学红 虞 桑 李效义 张茂先 首都医科大学生理学教研室，北京，100054 摘 要 自20世纪80年代以来，硬骨鱼类Mauthner(M)细胞一直是研究中枢神经系统 较好的模型。在神经通路、突触性质和中枢整合等神经学研究中，M细胞发挥了其他动物和 神经细胞难以替代的作用。实验中稳定地激活M细胞并准确定位记录电极是获取实验数据 的关键。本实验室结合多年实验经验对实验中经常遏到的问题及解决方法进行总结。 关键词 M细胞 逆向动作电位 逆向激活 负电中心 丘外的轴突帽中心即负电中心。非如此，任何下一步实验均难进行。初学者往往在这一关键步骤遇到 困难，其原因甚多，现结合本实验室多年积累的经验进行分析，同时提出克服方法，供有关人员参考。 一、逆向激活M细胞 记录某些动物的神经核团放电，可借助脑定位仪和图谱，直接将电极刺人核团内。与之不同，穿刺 M细胞并不能仅靠这类工具就可以准确定位M细胞，寻找M细胞主要依靠刺激脊髓逆向激活M轴 突，同时用记录电极在延脑搜寻其特征性的胞外电反应，因此必须确保每一逆向刺激均能稳定地使M 细胞激活。在M细胞未被激活的情况下搜寻其电反应是徒劳的，而且极易在完全盲目的穿刺过程中将 细胞损毁，导致实验失败。 以下情况常使M细胞不能稳定激活。 (一)动物一般状况不佳 饲养阶段或实验过程中氧供不足，麻醉过深或术中出血过多，往往导致M细胞功能状态不良，此 时，细胞对长时间重复刺激的耐受性降低，不能稳定地对每一逆向刺激都发生反应，遇有这种情况应及 时检查并调整循环水泵的流量，减少循环中麻醉剂的浓度，查看镜下脑血管血流状况。若脑组织的颜色 苍白，应及时更换实验动物。 (二)逆向激活故障 常见原因如下。 1．刺激电极位置不当 电极太靠近尾侧，只能刺激马尾和M轴突较细的末端而使逆向激活效果不佳，通常刺激电极安置 位置应与背鳍中线至前缘之间的区段平齐。 2．刺激脉冲强度或极性不当 轴突激活。但有时也会出现仅一侧M轴突活化，而记录侧的M细胞未被激活的情况。为避免这种情 第27分会场整合生理学——从分子到整体 507 况发生，在探查M细胞电反应之初，应试探性地改变刺激脉冲的强度和极性，选用在记录侧能引起稳定 。 的逆向动作电位，刺激伪迹小，反应潜伏期短，所需刺激强度低的刺激极性作为逆向刺激。 二、记录电极定位 根平齐。可在解剖镜下利用微推进器预先将微电极尖端放在中线旁开400t-m，延髓前1／3与后2／3交 界处，然后将电极快速推进到800～1000／-m的深度。由此，再以5肚m的步进距离向脑的深处探寻M细 胞的胞外反应。 按照解剖学位置预置记录电极只能是一个很粗略的定位步骤，因为鱼头部的固定并无严格的解剖 学标志作为参考点，每次固定很难保持同一方位，例如头固定时嘴部稍上仰，M细胞胞体的穿刺点就会 前移，有时胞体穿刺点可前移至延髓小脑交界处，反之，嘴部稍下垂，穿刺点将后移。如果采取侧斜位固 定，胞体穿刺点将反方向移位。例如，向左侧倾斜30。，左侧M细胞胞体的穿刺点可移至中线附近。由 此可知，将何处作为记录电极探查逆向反应的起点，要根据动物的固定情况，结合所探测到的反应情况 灵活变更。 三、逆向动作电位的特征及搜寻方法 Frshpan等对M细胞逆向动作电位的胞外电场特征及其空间分布规律有详细研究，是搜寻M细胞 的重要方法学依据。 以下的实践经验值得注意。 (一)细心辨认M细胞逆向动作电位的主要电生理特征 0．4～0．7ms的短潜伏期和具有全或无特点的负向波是认定为M细胞反应的两个重要特征。当发 现可疑的负向电位波动时，必须依据这两点仔细地反复辨认。在未探查到典型的M细胞反应之前常常 见到波形相似，但潜伏期稍长的分级性负向电位跟随于M细胞