基因工程与基因重组PPT.ppt

基因重组与基因工程;生物工程定义;生物技术的四大体系; 重组DNA技术（recombinant DNA technique），又叫DNA克隆（DNA cloning）。在体外将各种来源的遗传物质——同源的或异源的、真核的或原核的、天然的或人工合成的DNA与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（复制子），继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增，以获得该DNA分子的大量拷贝。这类克隆是在分子水平上操作，故又称分子克隆（molecular cloning）。; 从复杂的生物有机体基因组中，分离出目的基因片段。 用合适的酶切割目的基因和载体，产生匹配的末端 在体外，将目的基因片段连接到能自我复制的并且具有 选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子。 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称宿主细胞）， 并与之一起增殖。 筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。从筛选出的阳性克隆中提取出扩增的目的基因片段，供进一步研究使用。;基因克隆的基本步骤;粘性末端;酶切后的目的基因片段;重组质粒;筛(筛选);大量生长;您已经掌握基因克隆的主要步骤！;（二）重组DNA中的工具酶;1. 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）;限制酶的命名 限制酶的命名是根据含有该酶的微生物种属而定。通常有三个斜体字母的缩写表示。 第一个大写字母取自细菌属名的第一个字母； 第二、三个小写字母取自微生物种名的头两个字母； 第四个字母代表该微生物同种内不同的株系；如果同一株名发现几种限制酶，则根据其被发现和分离的先后顺序，用罗马数字表示。 例如，从大肠杆菌（Escherichia Coli）RY13株中发现分离的第一种限制酶，称为EcoR I。;限制性内切酶的分类和特点;回文结构 II类限制性核酸内切酶识别DNA 位点的核苷酸序列呈二元旋转对称，通常称这种特殊的结构顺序为回文结构。;II型酶切割双链DNA产生3种不同的切口： 在对称轴中心同时切割双链，产生平末端或称钝性末端（blunt end），如Hpa I：; 在对称轴两侧相对位点分别切割一条链。从 5’ 端切割产生 5 端突出的粘性末端，如EcoRI ：;表15-2一些常用的限制性内切酶位点; 一些限制酶虽然识别序列不完全相同，但能产生相同类型的粘性末端，称为同尾酶，所产生的末端称配伍末端（compatible end），可进行相互连接。产生平末端的酶切割DNA后，也可彼此连接。; 连接酶可催化DNA分子中相邻5 磷酸和3 羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接。常用的有T4（噬菌体）DNA连接酶和E.Coli DNA连接酶。; 名称 功能及应用 大肠杆菌DNA聚合酶I 以DNA为模板，催化5’ →3’ 核酸链的延长，另有3’ →5’ 的外切酶 大片段 （klenow） 活性。常用于DNA 3’ 末端的标记和填充、cDNA第二链的合成、 DNA测序。 Taq DNA聚合酶 以DNA为模板，催化5’ →3’核酸链的延长，另有弱的5’ →3’的外切 酶活性，耐高温。常用于PCR及DNA测序。 末端转移酶 催化NTP中的NMP通过其磷酸基与DNA 3’ -OH连接而使DNA链 延长，无需模板。常用于3 端标记或形成DNA共聚尾巴。 逆转录酶 以RNA为模板，合成cDNA链（5’ →3’），另有RNA酶H活性。常 用于cDNA第一、二链的合成及反转录PCR（RT-PCR）。 RNA聚合酶 以DNA为模板合成RNA。常用于