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应用免疫金标记电镜技术 定位寄主细胞中的植物病毒 孟春梅洪健 (浙江大学生物技术研究所杭州310029) 摘 要：应用免疫金标记电镜技术研究了侵染蝴蝶兰以及实验植物曼陀罗、苋色藜的建兰花叶病毒 mosaic (Cymbidium wires，ORSV)，通过低温 virus．CymMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossumringspot 包埋超薄切片，用蛋白A胶体金探针进行间接法免疫标记，电镜观察发现样品细胞内病毒内含体清晰可 见，金颗粒集中在病毒内含体或分散的病毒粒子上，特异性强，非特异性散在金颗粒少。健康样品内几乎 无金颗粒存在。 关键词：建兰花叶病毒；齿兰环斑病毒；寄主细胞；胶体金标记 胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种新 型免疫标记技术[1’2]，由于它不存在内源酶干扰及放射性同位素污染等问题，且利用不同颗 粒大小的胶体金还可以作双重甚至多重标记使定位更加精确。因此已成为继荧光素、酶、 同位素及胶乳标记技术之后的一种新型的免疫细胞化学定位标记技术。它能在超微结构 水平上精确、细致地定位，特异性高，标记物清晰可辨，具有其他标记方法无法比拟的优越 性，因而已广泛应用于生物学的各个方面，特别是在一些研究工作中越来越受到重视。 mosaic 我们应用免疫金标记电镜技术对侵染蝴蝶兰的建兰花叶病毒(Cymbidium virus，CymMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossumringspotvirus，0RSV)进行了观察研 究。CymMV和0RSV是兰科植物上发生最广泛的两种病毒，引起花叶、坏死、叶脉褪绿、 条斑等症状，复合侵染时可导致植株矮化、叶片畸形等重症，严重影响兰花的经济价值和观 赏价值。金标记电镜技术可以有效地定位观察寄主细胞内的病毒分布状态，为兰花寄主的 细胞病理学研究提供新的实验方法。 1材料与方法 1．1 材料 amabilis)采自于浙江森禾 感染建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的蝴蝶兰(Phalaenopsis 种业股份有限公司海宁花卉基地，在实验温室分别接种实验植物曼陀罗(Datura stramonium)和苋色藜(Chenopodium 1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma)，0．1mol／L · · 429 NaN 3。 1．2取材、包埋与切片 取感病蝴蝶兰、曼陀罗、苋色藜和曼陀罗、苋色藜健康叶片切成lmm×1mmX3mm的 镜下观察。 低温包埋参照林钧安等【。的方法。取病叶和健康叶片切成lmm×1mmX3mm的小 h， 7．2)中，4℃下固定2 块，立即放入4％甲醛和1％戊二醛的磷酸缓冲液(0．1mol／I。，pH 管．100％K4M继续渗透6h，然后分装在注满K4M的0．5mleppendorf管中，一20。C冰箱 中紫外线照射聚合72h，室温下聚合48h。 1．3胶体金标记、染色与电镜观察 胶体金标记方法参照胡东维等[_’‘的方法。包埋好的样品超薄切片，将有切片的镍网于 双蒸水上漂洗，BL溶液封闭。抗血清稀释200倍(BI。溶液稀释)．双蒸水漂洗，胶体金标记 抗体液1：30～l：100，双蒸水漂洗，醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，置于透射电镜下观察。 2结果 电镜观察负染色的病叶汁液可以看到许多线状或杆状病毒粒子．在复合侵染的病叶中 同时观察到两种病毒