水稻COPI蛋白β′亚基克隆、表达及功能分析研究.pdfVIP

摘 要 真核细胞的分泌和内吞主要通过膜泡运输的方式进行。介导膜泡运输的有被小 泡分三种:网格有被小泡、COPI有被小泡和COPE有被小泡。在酵母和哺乳动物中 关于有被小泡外被体的结构以及各组份如何相互作用确保蛋白货物分子的正确分选， 己经得到广泛的研究，而在植物中的研究相对较少。COPI外被体是一种胞质溶胶复 合物，由a,p、侧 、y,3,。和令COP七个亚基组成，本研究从水稻中克隆编码 COPI蛋白少亚基的基因，分析所获得的三个同源拷贝基因表达时空特性，制备抗 体检测该蛋白在水稻各组织内源表达情况，构建RNA干涉载体转化水稻植株，探索 该基因在水稻小稿发育中的功能。 研究取得以下主要成果: 1.从釉稻安农N中克隆到编码COPI蛋白侧亚基的三个同源拷贝基因，基因命 名为Osfl-copl,Os6,-cop2和Os,O-cop3。基因Os/1-copl和Os8,-cop2之间核酸序列 同源性和氨基酸序列一致性分别为98%和96%，而基因。sfi-cop3和Os,-copl与 。叨-cop2之间的核酸序列同源性和氨基酸序列一致性分别是78%与78%和81%与 81%。功能结构域分析表明无论是线虫、果蝇、酵母还是拟南芥、水稻甚至人，COPI 蛋白侧 亚基都有高度保守一致的WD40结构域，N端300个氨基酸内含有6个WD40 重复。同源性分析表明由低等到高等各物种中少-COP蛋白是一个相当保守的蛋白。 2.为了分析这三个同源基因表达时空特性，取釉稻品种安农N花粉母细胞时期、 减数分裂期、单核早期、单核晚期一二核晚期四个不同发育阶段的穗，未成熟叶和成 熟叶及幼苗作材料，RT-PCR和Northern杂交分析表明这三个基因都在水稻穗部特 异表达，且四个时期表达无明显差异:在叶和幼苗中表达量极低。 3.将基因。叨-cop2编码区全长及三种缺失片段CCOPI-p(氨基酸残基546- 907),SNCOPI-p，(氨基酸残基1-349),LNCOPI币’(氨基酸残基1-552)构建到表 达载体PQE-30中，其中只有CCOPI-A重组质粒诱导后在大肠杆菌过量表达，表达 的融合蛋白以包含体的形式存在，纯化融合蛋白，免疫家兔并成功获得特异抗血清。 利用获得的特异抗血清检测水稻内源尸-COP组织表达特异性。在水稻四个时期的 穗中都能检测到Os6,-copl和OSX-cop2。但在叶、’幼苗和根中都检测不到Os,-copl 和Osfi-cop2，蛋白水平证明Osfl-copl和Osfl-cop2在水稻穗部特异表达。 4.为了探索编码口-COP的基因在水稻中的功能，构建RNA干涉载体，农杆菌 介导法转化水稻品种中花II和石狩白茅，获得转基因植株，幼苗DNA潮霉素扩增表 明外源片段成功整合到水稻基因组中。RT-PCR和Northern分析证明转化苗中目的 基因被干涉，其表达水平明显下降，观察花粉育性显著降低，证明水稻中少-COP是 与育性相关的蛋白。 关钮词:水稻，COPI,侧-COP,WD40，表达，RNA干涉， 第一章 水稻COPI蛋白p亚‘基克隆及表达分析 1.1前言 在本实验室前期的研究中，利用抑制缩减杂交技术，构建了正常品种安农N和 温敏不育品种安农S-1之间减数分裂时期差异表达的cDNA缩减文库，筛选和鉴定出 了与温敏不育基因紧密连锁的cDNA片段HN57,测定了HN57的核酸序列，并通过同 源性分析，将HN57定位于水稻第二染色体31.2cM处BAC克隆OJ1006A02(序列号 AP003977)(姜大刚，2003)。用HN57序列进行BlastX(核酸序列搜寻蛋白序列) 发现该序列编码的蛋白为COPI(coatproteinI)的p’亚基，即p-COP。它不但 与第二染色体BAC克隆叮1006一02所编码的蛋白序列完全一致，而且与第六染色体 BAC克隆OSJNBa0007020(序列号AP003487)所编码的蛋白序列高度同源。 COPI小泡是内质网和高尔基体之间蛋白质运输的重要工具，在哺乳动物和酵母 中已经有深入的研究，但是在植物中相关的研究较少。COPI蛋白共有七个亚基， 尸-COP是其中的一个亚基。为了研究水稻尸-COP的表达时空特异性和在水稻小穗 发育中的功能，根据日本水稻基因组项目(RiceGenomeResearchProgram,Japan， RGP)水稻基因注释的数据 (http://ricegaas.dna.affrc.go.jp)分别设