阳离子膜融合脂质体介导的反义寡核苷酸肿瘤治疗的初步研讨.pdfVIP

阳离子膜融合脂质体介导的反义寡核苷酸肿瘤治疗的初步研究 胡 英1 2 金 一* 1 浙江大学药学院药剂教研室 浙江 杭州 310031 2 浙江医药高等专科学校药学系 浙江 宁波315100 反义技术是与目标靶基因 mRNA 或 DNA 特定互补的核苷酸片段以封闭有害基因表达的一种 [1] 方法 作为药用的反义寡核苷酸 antisense oligodeoxynucleotides, ASON 主要存在的缺点是细胞 膜的通透性低及易被核酸酶所降解 目前国内外的研究主要是采用不同的微粒载体来克服上述问题 据我们以前对阳离子膜融合脂质体 cationic fusogenic liposome, CFL 介导的ASON 细胞摄取效率 机制及保护ASON 免受核酶攻击的研究表明[2,3] CFL 是ASON 理想的传递系统 于是本研究进一步 探讨CFL 介导ASON 的治疗作用 以互补于端粒酶RNA 的ASON 作为模型药物 由于端粒酶具有 抗凋亡作用 通过抑制端粒酶活性可明显抑制肿瘤细胞的生长 并可诱导细胞凋亡 因此抑制端粒酶 的活性已成为治疗恶性肿瘤的新靶点 本研究是CFL/ASON 复合物处理7404 肝癌细胞 观察肝癌细 胞的生长增殖和凋亡情况以及 p53 蛋白和端粒酶逆转录酶 human telomerasereverse transcriptase,hTRT 的表达程度 为肝癌基因治疗提供理论依据以及CFL/ASON 复合物对黑色素瘤小 鼠模型的治疗研究 为该载体用于体内治疗作初步的探索 1 试药与仪器 1.1 试药 全硫代修饰的与端粒酶 RNA 模板区互补的 18 聚 ASON 序列为 5 -CTC AGT,TAG,GGT,TAG,ACA-3 全硫代修饰的无关反义寡核苷酸 N-ODN 序列为 5 -CAT,TTC,TTG,CTC,TCC,ACG-3 经微机检索均为与人类基因无同源性 由上海生工生物有限公司 合成 噻唑兰(MTT, Amresco 美国) 免疫组化 S-P 试剂盒 3,3’ 二氨基联苯胺 DAB hTRT 多克隆抗体 p53 单克隆抗体 DO- 1 均购于北京中山公司 RPMI1640 培养基 Gibco 公司 美国 超级小牛血清 杭州四季青生物制品所 聚碳酸脂膜是由美国Cincinnati 大学谢文锐博士惠赠 其他 试剂均为分析纯 1.2 仪器 旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂 超声波细胞粉碎仪 宁波新芝仪器研究所 酶联免疫检测 仪 ELX 800 BIO_TEK 光学显微镜(Olypus ,日本) CO2 培养箱(Thermo farma,美国) TGL- 16G 台式离心机(上海安亭科学仪器厂) 1.3 细胞模型 肝癌7404 和黑色素瘤B16 细胞是由浙江大学附属一院传染病研究所提供 在含10%超 级小牛血清的RPMI1640 培养液 37 5%CO2 的孵箱条件下连续培养 实验细胞均处于对数生长期 1.4 病毒 仙台病毒 Sendai virus Z 菌种 由日本大阪大学真弓忠范教授惠赠 感染9 天龄鸡胚进行 扩增 并测定凝血效价 2 实验方法 2.1 CFL 和 CL 及复合物的制备 用逆相蒸发法制备 称取大豆卵磷脂 胆固醇 DC-胆固醇 5 1 3 W/W 适量 制备方法参照[4] 2.2 形态学观察 上述各组细胞处理48 h 后 在光学显微镜下观察各组细胞的状态 1 2.3 四唑盐比色 MTT 法测定细胞抑制率 4 取对数生长期的7404 细胞悬液以 1 10 cells/孔接种到96 孔培养板 待80%细胞贴壁后 每孔 加不同浓度的N-ODN, ASON 及CFL/ASON 复合物 电荷比为4:1 另设脂质体和未处理的空白细 胞为