农杆菌介导法构建里氏木霉ura3基因突变体的研究.pdfVIP

第42卷第 7期 东 北 农 业 大 学 学 报 42(7)：147~153 2011年 7月 JournalofNortheastAgriculturalUniversity July2011 农杆菌介导法构建里氏木霉ura3基因突变体的研究 闫作梅，张 旭，李 杰 (东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030) 摘 要：构建了ura3缺失基因载体pEMT一／kura3，采用农杆菌介导法转-lEE氏木霉QM9414，在含尿嘧啶核 苷(1．87mg·mL-1)和五氟乳氰酸(5一FOA，5mgm·L-)的筛选培养基上筛选转化子，经表型验证和PCR检测，获 得 ra3基因缺失突变体 1株 ，ura3基因的同源重组率为 16．6％。采用农杆菌介导法将黑曲霉的p 基因导入 ura3基因缺失突变体中，使其回复野生型表型，从而建立了以pyra基因作为筛选标记的里氏木霉受体菌株。 关键词：营养缺陷型；农杆菌介导法；同源重组；ura3基因 中图分类号：Q785；Q814 文献标志码：A 文章编号：1005—9369(2011)07-0147-07 Constructofura3geneauxotrophicofTrichodermareeseibyAgrobac- terium tumefaciens—mediatedtransformation／YANZuomei，ZHANGXu，LIJie (CollegeofLifeSciences，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，China) Abstract：AbinaryvecterpEMT-Aura3withdeletedura3genewasconstructedinthisstudy．The deleted ura3 genewastransformed into TrichodermareeseiQM9414byAgrobacterium tumefaciens- mediatedtransformation．Transformantswereselectedonculturemedium containing 1：87mg ·m uracil and5mg·m 5-FOA．OneAura3auxotrophicstrainwasobtainedbyphenotypeandPCRanalysis．The levelofhomgousreocmbinationwas16．6％．FurthermorepyrA genefr0m A．nigerwastransformed into uridineauxotrophicura3mutantTrfchodermareeseLwhichcanrestorethephenotype．Onthebasedof thisworkatransform acceptorwasobtainedusingpyrAgeneasaselectablemarker． Key words：auxotrophic；Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation；homologousre- oc mbination；ura3gene 里氏木霉作为工业菌株，常用来生产多种重要 CBH／的基因失活，结果EGI的产量提高，不再产 的酶类，包括纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、淀 生 CBHI；1993年 ，Karhunen等将编码里氏木酶 粉酶等，具有巨大的商业价值[。目前，里氏木霉 EGI的基因置于强启动子 CBHI的控制下，用此表 的基因组测序已经完成，对于其基因的功能有待研