非电泳检测TSPY基因鉴定奶牛早期胚胎性别的研讨.pdfVIP

孛溪畜牧善医学会动耪繁夔学分会第十兰届学术磅讨会论文集 t非电泳检测TSPY基因鉴定奶牛早期胚胎性别的研究 黄金明术游伟谭秀文万发春刘晓牧宋恩亮 吴乃科 (由袤省农盈辩学院畜牧蒜医磷究所；出东省畜禽疫病防治与繁蠢重点实验室，出东济纛，250100) 摘要：睾丸特异蛋白(TSPY)基因是Y染色体特异基因。本实验首先采用血液制取的DNA模板对 设计合成的若千TSPY雄性特异引物和雌、雄共有引物进行了评估，通过优化PCR奈件以及测试不问 数量模板的扩增效果，使整个奶牛胚胎性别鉴定体系基本建立，并获得了可在相同条件下扩增且灵 性黪异标记。劳方便挂剐鉴定方法在现场应用，还初步建立了PCR产物捡测的非电泳方法。然后， 对不同方法提取奶牛胚胎细胞DNA模板的效果进行了研究，获得可整的模板詹，利用血液模扳建立 的方法进行了胚胎的性别鉴定，同时分别采用LAMP法进行验证，结果二者完全一致，更进一步说明 了本方法的可靠性。 关键词：牛；胚胎；PCR；性别鉴定；TSPY基因； 我国已利用牛的SRY基因和ZFY基因等建立了牛胚胎性别鉴定的PCR技术娃_’，但在该技术产业 化方面的工作还比较薄弱，迄今尚未开发崮商业亿的试剂盒供生产瘟震。扶圈际范围看，美国、法 国、芬兰、日本等国已推出了几款产品，但价格昂贵，推广单位鉴定一枚胚胎的试剂费用在百元人 民币以上。 ． 奶牛胚胎性嗣签定技术是否成功，取决于其灵敏度和稳定性。由于从瓤胎取军譬的纲胞样品缨胞 数圉较少，其灵敏度如何至关重要。良于SRY、ZFY等为单拷贝基因，国内外多采取相同引物对两次 扩增法或巢式PCR法扩增雄性特异基因，并采用电泳的方法检测产物，花费的时间较长。 Y染色体编码的睾丸特异蛋囱TSN(testis-specificprotein)是￥特异基因例。入类、马帮 牛中都存在TSPY家族“1。人类和牛TSPY基因的表达局限子雄性生殖细胞及其前体(精原细胞和精 母细胞)，并且始于胎儿的发育期。牛的TSPY基因由7个外显子组成，并被6个内含予分隔。牛和 人类的綦因组都是高度保守的，都是Y～特羿基因家族中的一部分。男性TSPY基因的拷贝数膏20—60 方法翻。目前，还没有利用幅PY基因鉴定奶牛泽期胚胎性别的研究报道。 本研究最终基的在于利耀多拷贝基因建立更加灵敏的PCR反应体系，研制成本低廉、简便易用、 灵敏度高、适于奶牛胚胎性别鉴定的PCR试剂盒，以便生产推广应用。 1材料与方法 1．1材料 公母牛血样采自山东省农业科学院试验牛场。颈静脉采血lOml，柠檬酸钠抗凝，一20℃保存备 用。本实验所用酶天DNA和DL2000购自大连宝生物，PCR试剂贿皇大连宝生物和青岛生工，引物由 DNA Enginel。(MJResearch)。紫外透射仪 上海生工生物工程服务有限公司合成。PCR仪为PTC-200 (302nm)，冷冻离心机(美国)。紫外可见分光光度计(Inspec3100，美国)测定DNA纯度。 l。2血液模板於制备 将冷冻豹血液在37℃水浴中融化后，各取100u DNAExtractionKit)提取高纯度的DNA，提取方法按试剂盒说明进行。用入DNA(未酶切)估测模 1出东省辩技攻关项目(031020108-1)；所青年基金项目(200302) 202 中豳畜牧兽医学套动物繁殖学分会第十点届学术研讨袅论文集 板DNA浓度。 1．3胚胎的来源和分割取样 对澳大利亚荷斯坦牛采用常规超数排卵技术获取的发育至桑椹期的A、B级和废弃的冷冻胚胎刚。． 金属刀片割取胚胎。 1．4胚胎DNA模板的制备 l。4。l热处理 lI 离心，取上清夜备用。将制好溶液的分别加入雄性特异引物管和共有引物反应管各5 1。 l。4．2碱处理 1ALB 将胚胎样晶用PBS洗3次，用吸管转入0．2mlPCR管中(约2tJ1)，PCR管中预先放入5|l (50mMDTT