豆豉纤溶酶产生菌的筛选及诱变研究.pdfVIP

豆豉纤溶酶产生菌的筛选及诱变 范晓丹郭勇 华南理工大学生物科学与工程学院，510640，020—871 13847，xiaodanf@sohu．corn 从广泛收集的豆豉成品及半成品中筛选到数株菌落形态各异且具有纤溶酶活性的 菌株：分别采用亚硝酸和紫外线对豆豉纤溶酶产生菌DC．12进行诱变育种，筛选 到的突变株的纤溶酶产量较出发菌株分别提高了3．6倍，3．7倍和4．75倍。 亚硝酸诱变筛选结果 经过初筛和复筛后，我们发现DC-N8和DC-N10的水解圈的确明显比出发菌株 DC．12大，结果见图1和表1。 图l 经亚硝酸诱变突后体外溶纤试验结果 表1 亚硝酸突变株体外溶纤试验结果 0的酶活力 从表1可以看到，用亚硝酸诱变处理后得到突变株DC．N8和DC—N1 比出发菌株分别提高了3．6倍和3．7倍，在本实验条件下，它们的产酶量分别达到 1-U／ml。 250IU／ml和260 紫外线诱变筛选结果 经过初筛和复筛后，我们发现DC．U8的水解圈的确明显比出发菌株DC一12大， 但和DC．N10的水解圈却比出发菌株DC．12略小，结果见图2和表2。 147 图2 菌溶圈圈结果比较 表2紫外突变株体外溶纤试验结果 从表2可以看到，用紫外线诱变处理后得到突变株DC．U8的酶活力比出发菌株 提高了4．75倍，在本实验条件下，它的产酶量达到380IU／ml。 讨论 在微生物诱变育种中，诱变剂量的确定直接影响到诱变工作的成败。在这方 面尽管有许多前人的经验可供借鉴，但由于不同微生物的遗传背景不同，因此具 体到某种菌株，要想获得理想的诱变效果，还需要通过实验来摸索一个较佳的诱 变剂量。有人认为采用高剂量，就是造成菌株致死率在90％～99．9％时的剂量能获 得较高的正突变率，可以淘汰大部分菌株，减少筛选工作负担；但也有人认为采 用低剂量(致死率在70％一80％)，甚至更低剂量(致死率在30％一70％)，能提高 正突变率，而负突变较多出现在偏高的剂量中¨91。在本实验中，我们采用致死率 为70％～80％时的诱变剂量，取得了较好的诱变效果。 由于微生物经亚硝酸诱变后，其突变需要经过几代复制后才能表现出来，并 趋于稳定，因此诱变后的菌液需要在营养丰富的培养基中进行一定时间的后培养。 本实验采用了在LB培养基中培养2h。 突变株的筛选模型是诱变育种的又一个关键问题。由于在初筛时需要筛选大 量的菌落，故必须选择一个高效的筛选模型，以减少筛选的工作量，提高筛选效 率，而对筛选的准确性不必苛求。在本实验中，我们采用改良纤维蛋白平板法进 行纤溶酶产生菌突变株的筛选。在纤维平蛋白平板中加入少许培养基(LB)，既能 使菌生长，又可作为筛选平板。通过纤维蛋白水解圈大小，一步筛选出产纤溶酶 活性较大的菌株。从初筛平板上挑选出溶解圈比出发菌株大的菌落，有可能就是 所需要的正突变株。该法简便快捷、直观可靠。 虽然纤维蛋白平板水解圈的大小直接反映了纤溶酶活力的高低，但仅以水解 148 圈的大小作为菌株产纤溶酶活力大小的唯一定量指标是不太可靠的。其原因是多 方面的，比如不同菌株具有不同的生长和产酶速度及不同的纤溶酶系；菌苔大小及 在平板上堆积情况的差异；筛选平板内纤维蛋白分布不均一等。所以通过液体发 酵进行复筛是必不可少。为此，我们先进行种子扩培后，按一定接种量接种到三 角瓶的液体培养基，振荡培养72小时后再进行酶活的定量测定，这样的结果就能 完全代表菌株的产酶能力。DC-N12菌株经复筛后，发现其纤溶酶活力几乎跟出发 菌株一样，这也说明了复筛的必要性。 参考文献 。 a1．Anovel the H，HamadaH，Tsu