试验五聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳法.PDF

实验五 聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳法 鉴定胰岛素 Exp. 5 Vertical gel electrophoretic assessment of insulin 凝胶电泳分类 聚丙烯酰胺凝胶电泳:用于分离蛋白质和寡糖核 苷酸  一维电泳 普遍采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）  连续电泳:电泳系统使用相同孔径的凝胶和相同缓冲系统的样品缓冲液、凝胶缓冲 液和电极缓冲液，且pH值恒定，只是离子强度不同的区带电泳。使用这种电泳系 统分离蛋白质，分子筛效应不明显，只用于分离组分比较简单的样品，且没有堆积 胶的浓缩作用，分辨率较低，加样时必须加成一条极窄的带，使样品能很好分离。 但如果高分辨不是实验目的，用这种方法制胶快而简单。  不连续电泳: 不连续电泳是指使用不同孔径和不同缓冲系统的电泳。由于浓缩胶的 堆积作用，可使样品（即使是稀样品）在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带， 然后在一定浓度（或一定浓度梯度）的凝胶上进行分离。由于不同孔径凝胶的分子 筛作用，使不连续电泳的分辨率大大高于连续电泳。虽然不连续电泳在缓冲系统的 选择和制胶（特别是梯度胶）的操作方面比较繁杂，但它可以得到电泳分离最重要的 指标--高分辨，因而是目前应用最广泛的技术。 pH 8.9 Tris/Gly buffer 浓缩胶 样品缓冲溶液 pH 6.7 Tris/HCl buffer Tris/HCl pH 6.7 分离胶 Tris/HCl pH 8.9 Tris/Gly pH 8.9 迁移率= ( 电压x 样品净电荷)/摩擦力  普遍采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE ）  非变性电泳(native PAGE)分离蛋白复合物时经常用 到  变性电泳SDS，在凝胶与缓冲系统中加入阴离 子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS），蛋白质分子 被大量SDS阴离子包裹，消除了它们间原来携带的电 荷差别，因而其迁移率仅反映蛋白质分子大小，故广 泛用于蛋白质分子量的测定。 一、实验原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺作为支持物的一 种电泳形式。 1.制胶原理 单体丙烯酰胺（Acr ） 决定胶孔大小 甲叉双丙烯酰胺（Bis ） 过硫酸铵（APS ） 化学聚合(决定凝胶时间长短) 四甲基乙二胺（TEMED ） 2. 分离原理 （1）电荷效应 在不同的pH条件下蛋白质所带电荷 不同在一定的电场条件下蛋白质将向与其所带电荷相反的 电极方向移动。电荷多，迁移率大；电荷少，迁移率小。 （2 ）浓缩效应 a.胶孔不连续 浓缩胶:3％, 分离胶:7.5％ b. pH值与离子成分不连续 c. 电位梯度不连续 （3）分子筛效应 分子量小，球形的迁移率大 分子量大，纤维状的迁移率小 在非变性电泳中，天然蛋白质的分离就是蛋白质所带电 荷、分子大小及分子形状共同影响作用的结果。 pH 8.9 Tris/Gly buffer 浓缩胶 样品缓冲溶液 pH 6.7 Tris/HCl buffer Tris/HCl pH 6.7