PKIP在大鼠肝纤维化发生机制中的作用研究.pdf

中文摘要 RKIP在大鼠肝纤维化发生机制中的作用研究 摘 要 fibrosis)是肝硬化乃至肝功能衰竭的共同病理基础 肝纤维化(hepatic 和必经阶段，是影响慢性肝病的重要环节，因此肝纤维化的预防、治疗乃 至逆转是阻断肝硬化的关键环节。肝纤维化也成为国内外学者研究慢性肝 病的焦点。我国是肝病高发国家，以慢性乙型、丙型病毒性肝炎最为常见， 在目前尚无良好的抗病毒药物的情况下，阻止或逆转肝纤维化进程成为治 疗慢性肝病的重要对策。 生理状态下，HSCs在维生素A代谢和维持肝脏构架(产生细胞外间 质和通过收缩作用调节窦状隙血流)中起重要作用。在慢性肝损伤过程中 HSCs经历了表型转化(激活)，变成了高增殖活性的类维生素A缺乏细胞 过程中具有重要的作用。激活的HSCs获得不断增殖，合成大量的ECM 分子，分泌细胞因子和生长因子，迁移和收缩的能力。肝星状细胞在塑料 培养皿中进行体外培养时使HSCs的活化过程得到很好地重现。 状态。Ra￡1／ME班RKl，2信号通路的激活可以促进细胞生长，分化和迁 接着磷酸化和激活ERK。磷酸化的ERK进入细胞核通过结合多种转录因 子来调节基因表达，进而促进了致纤维化蛋白分子的表达。 浆蛋白，与其它的激酶抑制剂没有同源性，是人们目前发现的唯一的Raf-1 磷酸化，干扰Raf／MEK结合，抑制MEK和下游分子的活化来达到负向 中文摘要 解离导致G蛋白信号通路的活化。有数据表明RKIP被PKC磷酸化后能 明是一个抑制肿瘤细胞侵袭扩散的蛋白分子，包括前列腺癌，恶性黑色素 瘤，乳腺癌，胰岛细胞癌，直肠癌和肝癌。RKIP在MDCK表皮细胞中的 作用则相反，RKIP过表达能使MDCK由表皮细胞转化为成纤维样细胞并 移抑制剂。进一步的研究证明RKIP在正向调节细胞与基层黏附和负向调 节细胞与细胞的黏附过程中具有重要作用。 HSCs细胞形态改变和运动迁移构成了一系列肝纤维化生物过程的重 要部分。尽管RKIP在MDCK表皮细胞和高侵袭力肿瘤细胞中的作用已 经得到揭示，但是RKIP在肝纤维化形成时HSCs中的作用却知之甚少。 在本实验中，我们将揭示RKIP在肝纤维化组织的表达及其在HSCs细胞 增殖和迁移中的作用。实验内容主要包括以下3部分： 动态表达情况 目的：研究RKIP在胆总管结扎肝纤维化大鼠肝脏组织的表达情况。 方法：运用胆总管结扎方法制作大鼠肝纤维化模型，模型组分别于结 扎后l周、2周、3周、4周麻醉动物，假手术组与4周模型组同批麻醉， blot和免疫组织化学方法检测RKIP在肝组织的表达，用Westernblot方 法检测RKIP和ERK的磷酸化水平。 结果：①HE和Masson三色染色结果证明胆总管结扎大鼠肝纤维化 模型制作成功。②RKIP在大鼠肝组织的免疫组织化学定位：RKIP在正 常大鼠肝组织的肝细胞、胆管周围细胞、血管内皮细胞和肝窦周围细胞中 均有表达，分布在细胞胞浆和胞膜；随着肝纤维化的发展，大鼠肝脏中 RKIP阳性细胞明显减少，与肝细胞相比RKIP在汇管区和纤维间隔的成 维细胞中表达较少，但在肝细胞胞膜中的表达增强。造模1--4周大鼠肝组 blot分析结果显示，RKIP 正常对照组(89．25：1．3)％，P0．05。③Western 中文摘要 在模型组3~4周肝纤维化组织的表达较假手术组下降，假手术组 (54．5±2．8)％和(41．05：1．8)％。ERK的相对表达量没有明显变化，假手术组 (132．1+7．7)％，(277．7+4．8)％和(332．9+7．4)％。 结论：胆总管结扎大鼠肝纤维化形成过程中，肝脏组织磷酸化ERK 达水平下降，同时磷酸化RKIP水平升高，肝纤维化过程中肝脏组织 化增加有关。 第二部分：RKIP在大鼠原代肝星状细胞活化中的作用 目的：体外分离大鼠原代HSCs，研究RKIP在大鼠原代肝星状细胞 激活前后的表达情况。 方法：应用台盼兰染色，观察细胞存活率。应用荧光显微镜观察刚分 离大鼠原代HSCs的自发荧光，以做特异性细胞鉴定。应用单克隆抗体 tt-SMA做免疫细胞和Wester