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siRNA沉默hTERT基因对人胰腺癌的凋亡和耐药基因的影响 中山大学附属第二医院消化内科 博士学位申请人 钟英强 导 师 朱兆华教授 摘要 翮 吾 cancer，PC)是消化系统中较常见的恶性肿瘤之一， 胰腺癌(pancreatic 且近年来全球胰腺癌发病率呈上升趋势，我国胰腺癌发病率在近20年内增加了 4倍。目前所采用的化疗、放射、免疫和内分泌等非手术疗法，对胰腺癌的疗效 均较差，其主要原因之一是与胰腺癌组织中的端粒酶(telomerase)、抗凋亡基 因和耐药基因的高表达有关。近几年来，虽然胰腺癌的临床多模式综合治疗水平 不断提高，但对其远期疗效和预后并未带来突破性的进展，随着分子生物学及相 关学科研究的深入，胰腺癌的基因治疗被认为是继手术、放疗和化疗等传统疗法 之后肿瘤治疗的新模式。 人类端粒酶主要由3个亚单位组成：端粒酶RNA、端粒酶结合蛋白和端粒酶 逆转录酶(humantelomerase陀verse 作为引物，以自身RNA组分为模板来逆转录合成端粒DNA序列，并不断添加到染 色体末端，从而维持端粒长度的稳定。hTERT在体内外组织细胞中均与端粒酶活 性密切相关。近期的研究表明hTERT只在端粒酶阳性细胞中表达，hTERT所编码 的基因mRNA水平与端粒酶活性一致，是端粒酶活性表达的限速因子。因此，调 控hTERT的表达已成为调节端粒酶活性的主要手段，而hTERT基因是当前端粒酶 基因治疗的主要靶点之一。近年来，随着对hTERT的功能的深入研究发现，hTERT 除调控端粒酶活性外，还可调节控制细胞生长的多种基因的表达，抵抗肿瘤细胞 的凋亡作用和对DNA损伤有修复功能，hTERT的上调与其他基因共同促进肿瘤的 发生，而这些功能不依赖于端粒的稳定性，即是hTERT的端粒外功能，已成为目 前研究的热点。 关的基因，其表达产物COX蛋白，为花生四烯酸代谢过程的关键酶。而COX-2促 进肿瘤的发生是否与hTERT有关，国外有个别文献报道COX-2抑制剂对端粒酶的 活性有影响，未见在基因水平上进行两者的关系研究。 多药耐药(multidrugresistance，MDR)基因是导致许多肿瘤化疗失败的 药物排出泵，通过ATP提供能量，将化疗药物由细胞内泵出细胞外，使其抗肿瘤 细胞作用减弱或消失而表现为耐药性，因此，P—gp可作为化疗的敏感指标之一。 MDR表型的细胞常呈现出抗细胞凋亡特性，其可能是MDR的本质之一。 Bcl-2是一种凋亡抑制基因，其过度表达使化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用 转变为对细胞死亡的抑制而致耐药，故Bcl一2被认为是一种新的耐药相关基因。 研究表明Bcl一2过度表达常伴端粒酶活性的增高。 RNA干扰(RNA 念和途径。双链RNA(double．StrandedRNA，dsRNA)能抑制同源互补序列的基 因表达，称为RNAi。RNAi可以高效、特异的阻断体内特定基因表达，促使mRNA 降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型。RNAi是一种转录后基因表达的调控 机制，目前被广泛应用于功能基因组和基因治疗的研究。RNAi技术能抑制特异的 基因表达，治疗恶性肿瘤，能减少非特异作用引起的副作用。因此，siRNA不仅 被用作探讨细胞基因功能的工具，而且可应用siRNA抑制致病基因的表达，开拓 出治疗各类疾病，特别是恶性肿瘤的新型基因药物。 研究目的 本课题是应用免疫组织化学染色技术，在蛋白质水平上研究hTERT基因在 人胰腺癌组织中的表达及其与P—gP、Bcl-2、COX一2蛋白表达和临床病理特征的 关系。利用RNAi技术靶向沉默胰腺癌细胞的hTERT基因表达，在基因水平上研 COX-2基因表达的影响。 材料与方法 主要材料 l 胰腺癌手术切除后存档的石蜡包埋标本38例，慢性胰腺炎标本25例，正常胰 腺组织标本20例。 2人胰腺腺癌Capan一2细胞株、SWl990细胞株。 3