马铃薯YN病毒CP基因的原核表达及特异性抗血清制备研究.pdfVIP

马铃薯Y”病毒CP基因的原核表达及 特异性抗血清制备 马纪，白艳菊，吕典秋，于德才，李学湛 (黑龙江农业科学院植物脱毒苗木研究所，哈尔滨 150086) 摘要；依据马斡薯Y、病毒(PotatoViresLPvY)外壳蛋白(cP)基因序列设计合成了 两对引物．通过RT_PcR扩增得到目的片段．将目的片段转入大肠杆菌，醇切鍪定证明得 到了台有目的片控的重妞于．测定序列站果与其他PVY分离物CP基阁的序列比较．发现其 柱苷酸鸸涎性迭969o左右；构建了台PVYCP基圜的融各蛋白厦拄表速栽体，并在大舾孝于苗 中得到表选，表选产物纯化。免疫宰兔，获得抗血清．I砖提取和酶标记lgG可用于ELISA 检测马铃薯Y病毒。 关键词：马铃薯Y”病毒；外壳蛋白基因；原核表迭；抗血清；DAS—ELISA捡测 马铃薯Y病毒是马铃薯生产上非常重要的一娄病害．分布于肚界各马铃磐产 区，常引起马铃薯退化，并影响产量．与马铃薯溢叶病毒复合侵?{!=可造成严重减 产，达80％以上Ⅲ，是马铃薯生产中的主要限制因子，可机械传毒，也可通过蚜虫 传毒l”。 血清学病毒检测技术已经非常成熟01，为病毒研究普遍采用，抗血清制备的常规方 法为采用指示植物分离、纯化、提纯和免疫家兔获得M，随着分子生物技术的飞速发 展，从分子水平构建病毒外壳蛋白作为抗原免疫获得病毒抗血清．国内外许多报道表 明，该方法同样可以用于病毒检测Ⅷ。这种方法已应用于多种马铃薯病碡CP基因原核 表达制备病毒抗血清m。 1材料与方法 I．i菌种与质粒 大肠杆菌DH5a株系由本所保存，质粒pBSK南哈尔滨医科大学提供，质粒pGEX— TEasy Vector购白Promcga公司。 1．2工具酶及试剂 DNA聚合酶、TrizaI 限制性内协酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、Taq RNA提取试 tl GelExtraction 剂盒、dNl’P、QIAEX Kit、马铃薯病毒DAS—ELISA检测试剂盒分别购 自上海生工生物技术有限公司、Promega公司和瑞士Bioreba公司。 1JPw的分离与鉴定 1．3．1 PVY样品 采自黑龙江省哈尔滨市郊区；马铃薯品种：大西洋。取样品植株叶片汁液，1％磷 钨钠负染后电镜观察。利用马铃薯病毒DAS—ELISA检测试剂盒进行检测，具体方法按 说明书。 1．32 生物学鉴定及分离纯化 floridana)对病毒进行鉴定及单病斑分离纯化， 通过接种枯斑寄主洋酸浆(Physalis tabacum)上保存备用。 接种于黄苗榆烟(Nicotiana 1．4 RT—PcR扩增目的基因 1．4．】 引物设计与合成 CP基因，引物为上海生工生 依据PVYCP基因设计合成了一对引物用于扩增PVY 物工程有限公司合成。 病毒RNA的提取：采用髓zol RNA提取试剂盒提取带毒烟草叶片总RNA， Reagent 以此作为病毒RNA进行试验，圊时提取健康烟草叶片总RNA，作为健康对照。具体方 法按试剂盒进行说明。 1．4．2反转录 y．mo]]L rain， 1拉L，95％变性10 在Eppendorf管中加入RNA提取液5皿、引物10 1 立即置于冰上5min；然后加入下列物质：反转录酶1¨L，RNA酶抑制剂1td-．、dNTP h，95％5min终止反应。