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第十五章 基因工程 ELISA检测技术：ELISA（enzyme linked immuno-sorbent assay）是一种固相免疫检测技术。比较常用的方法有用于检测抗原的双抗体夹心法和用于检测抗体的间接法两种。因此，基因工程中用于检测克隆基因表达产物的方法主要是双抗体夹心法。 优点：能进行定量检测，因此该方法更多地用于基因表达产物的定量分析。 缺点：较繁琐。基因必须表达。 分子杂交技术检测法：包括菌落或噬菌斑的原位杂交技术。 优点：方法简便、快速。 缺点：必须具有相应的探针。 杂交抑制翻译法：该方法用于cDNA文库中目的基因的筛选。其原理是利用cDNA与mRNA杂交后导致mRNA的不能翻译，从而筛选阳性克隆子。 优点：不需要克隆基因的表达，不需要探针或抗体。 缺点：较烦琐。 DNA序列分析：该方法通常是用在目的基因筛选后最终的鉴定。 各克隆子提取相应的cDNA 从cDNA文库相应的细胞提取mRNA 混合杂交 无细胞翻译体系（麦胚或网织红细胞提取物）体外翻译 35S标记甲硫氨酸 聚丙烯酰胺凝胶电泳 放射自显影 分析比较，找出目的蛋白不合成的克隆子即为目的基因 PCR 第六节 文库的构建 一、cDNA文库（library）的构建 cDNA文库是指得到足够多的分别克隆的cDNA片段，汇集这些克隆应包含某种细胞中各种mRNA的相应顺序，每种顺序至少有一份拷贝，这种克隆片段的汇集体称为某种细胞的cDNA文库。 为了得到特定基因的cDNA片段，就需要先分离出有功能的特定mRNA。所以首先必须考虑从什么细胞，用什么方法将ｍＲＮＡ提取出来。这是由于不同细胞可限定合成不同的蛋白质，这样在一些组织细胞中除了含有普通蛋白质的mRNA外，还会有数量较多的特定mRNA。 mRNA的分离有许多种方法，例如化学的方法，物理的方法（如差速梯度离心法）等。有的还可以利用真核生物的mRNA具有的poly A尾巴进行亲和层析法分离mRNA。有的则采用几种方法联合使用，其总的目标就是获得纯度高、得率高的有活性的mRNA。  在取得mRNA后，接下来就是将mRNA通过反转录酶合成杂种DNA链（DNA-RNA分子），在碱（KOH）作用下水解RNA链，然后经DNA聚合酶I作用再合成第二条DNA链，即形成双链cDNA分子，将双链cDNA插入载体后形成重组体，并导入细菌中，随细菌的繁殖而扩增和克隆，形成cDNA文库 。 二、基因组文库的构建 基因文库（gene library）：用重组DNA技术将某种生物细胞的总DNA或染色体DNA的所有片段随机地连接在载体上，然后转移到适当的宿主细胞中通过细胞增殖而构成各个片段的克隆。当制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体就称为某种生物的基因文库。同一定义也适用于线粒体或叶绿体ＤＮＡ的基因文库。由于制备ＤＮＡ片段的切点是随机的，所以每一克隆内所含的ＤＮＡ片段即可能是一个或几个基因，也可能是一个基因的一部分或除完整基因外还包含着两侧的邻近ＤＮＡ顺序。 基因文库的构建就是利用所谓的“鸟抢法”，使基因组的DNA片段随机地插入适当的载体中，导入细胞进行大量繁殖而构建的。  用于构建基因文库的片段的产生大致有两种方法，一是用限制性内切酶完全消化基因组DNA，这个方法有两个特点。第一是假如所需的基因含有所用限制酶的识别位点，那么这一基因将被克隆在两个或数个片段中，给研究带来一定的困难。第二，一般常用的限制酶大多识别六个bp序列，切割DNA所产生的片段的平均大小相对比较小（约4kb即46＝4096bp），因此整个基因文库要含有非常大量的重组体，这样应用分子杂交法进行筛选就十分费事费时。虽然可以用限制酶进行部分消化，产生约20kb的片段，但这种方法必须掌握好酶解的条件。 用于制备基因组文库的随机片段的另一种方法是采用机械随机切割。这种方法可以制备大片段的DNA（用噬菌体λ作载体约20kb，以cosmid作载体约45kb ），从而克服上述的两个缺点。但是这种方法的不是之处是：所制备的片段的末端顺序是随机的，还必须经过末端修复，人工制造接头等手续才能与载体ＤＮＡ进行连接。 用于基因文库构建的载体常用噬菌体λ或cosmid载体，因为它们的容量比较大，可克隆大片段的DNA。虽然cosmid载体比λ载体的容量大，但由于文库的保存（cosmid载体在E.coli中， λ载体在噬菌体中） λ比cosmid容易，因此λ载体用的更多些。 基因组文库的克隆数：由于基因