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人波形蛋白重组质粒表达对乳腺癌的增殖和侵袭的研究 作者 贾永喜 学位 硕士 指导老师 魏于全 教授 前言 细胞骨架(cytoskeleton) 前言 中间丝(Intermediate filamenis，IFs) 前言 Vimentin（Vim，波形蛋白） 前言 基于vimentin在癌细胞中表达是否为增强癌恶性程度的重要因素，明确波形蛋白对乳腺细胞表型的影响及其作用机制，本研究拟通过分子克隆技术构建的人vimentin基因真核表达质粒载体转染MCF-7乳腺癌细胞并筛选稳定表达细胞株，体外检测表达重组波形蛋白后对乳腺癌细胞增殖和侵袭能力的影响。 实验思路 双酶切验证vimentin真核表达质粒 pcDNA3.1-Vim。 pcDNA3.1-Vim 转染MCF-7 细胞 RT-PCR检测细胞内质粒表达 流式细胞术检测细胞内质粒表达 MTS细胞增殖试验 细胞体外侵袭实验 方法 验证vimentin真核表达质粒 pcDNA3.1-Vim。 将得到的pcDNA3.1-Vim 用BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳后鉴定重组子。 方法 按照以下配制20ul反应体系，置37℃孵育5h: 试剂 体系 pcDNA3.1-Vim 10ul 10xBuffer(yellow) 4ul BamHⅠ 1 ul EcoRⅠ 1 ul ddH2O 4ul 方法 pcDNA3.1-Vim 转染MCF-7 细胞 用10％小牛血清的DMEM常规培养MCF-7细胞，按每孔105细胞数500μl培养基细胞悬液接种24孔板，次日参照Lipofectamine 2000试剂说明书按pcDNA3.1-Vim和pcDNA3.1（+）各0.8μl、脂质体2μl分别转染HepG2细胞。 方法 G418筛选稳定表达细胞株 转染后48h，换800μg/ml G418选择性培养基继续培养。未转染质粒的MCF-7细胞对照组于筛选10天全部死亡，转染pcDNA3.1-Vim和pcDNA3.1（+）的细胞筛选3周后，将G418浓度维持为400μg/ml培养。建立的稳定转染细胞株MCF-7-pcDNA3.1(+)和MCF-7-pcDNA3.1-Vim分别命名为MCF-7-p和MCF-7-pV 方法 RT-PCR 分别收集约106细胞数MCF-7-pV和MCF-7-p及未转染的MCF-7细胞，依照Trizol试剂说明提取总RNA，用克隆Vimentin基因的引物，同时在相同反应体系中加入β-Actin（1128bp）引物作为内参，按TakaRa试剂盒On Step RNA PCR Kit（AMV）一步法RT-PCR，检测三种细胞内Vimentin基因的表达情况 方法 流式细胞术 分别收集约105细胞数MCF-7-pV和MCF-7-p以及未转染的MCF-7细胞，4％多聚甲醛固定，0.1％皂素细胞膜打孔，用小鼠抗人单克隆一抗Vimentin 3B4和兔抗小鼠荧光标记二抗免疫荧光标记细胞，流式细胞术检测荧光强度 方法 MTS细胞增殖试验 分别收集用0.25％胰蛋白酶消化生长状态良好的MCF-7、MCF-7-p和MCF-7-pV细胞，10％小牛血清DMEM培养基重悬，严格控制稀释细胞密度均为5×104/ml，每个孔加入细胞悬液100μl，每种细胞6个复孔接种96孔板，三种细胞和一个阴性对照（仅加等量培养基无细胞的6个孔）共为4个组，置37℃、5％CO2增湿孵箱培养。第二天开始观察细胞生长状况，至接种后72h，细胞融合度到达90％左右，按照Promega公司CellTiter 96? AQueous One Solution Cell Proliferation Assay说明书直接在每孔中加入该试剂20μl，置上述培养箱内孵育3h后酶标仪490nm波长读取吸光度并记录。 方法 细胞体外侵袭实验 按照BD Biosciences公司BD BioCoatTM Growth Factor Reduced MATRIGELTM Invasion Chamber说明书，取9个小室分三组置24孔板内，每个小室内加入500μl 37℃无血清培养基，置细胞培养箱内水化2h。分别收集用0.25％胰蛋白酶消化生长状态良好的MCF-7、MCF-7-p和MCF-7-pV细胞，无血清DMEM培养基重悬，严格控制稀释细胞密度均为5×104/ml，每个小室内加入细胞悬液500μl，每种细胞三个小室为一组