病毒性肝炎的基因治疗研究.pdf

童苎查篁三星塾兰垫查兰查堑叁 !!! 病毒性肝炎的基因治疗 牛俊奇王胡 王美霞任 娜 (吉林大学第一医院 长春 130021) 摘要：目的：观察小干涉RNA、脱氧核酶及U．嵌合体核酶在细胞水平上对HBV、HCV基因表达的 载体和HCV亚基因组真核表达载体共转染Huh7细胞，观察荧光素酶表达和荧光强度的改变。结果：HBV 染细胞的HBV HCV (抑制率88．33％和89．45％)，至96小时仍有一定抑制效应。U-．嵌合体核酶转染细胞后荧光素酶-q 87．46％的表达。结论：HBV特异性小干涉RNA、 融合蛋白的表达量减少，在Huh7细胞中可抑制靶HCV 10．23脱氧核酶可有效抑制HBV基因表达，U一嵌合体核酶具有切割靶HCV的能力。 关键词：乙型肝炎丙型肝炎小干涉RNA脱氧核酶核酶基因治疗 迄今为止，针对慢性乙、丙型肝炎的抗病毒治疗尚无理想药物。基因治疗是目前抗病毒治疗研究的热 C区的特异性核酶，以U。小核核糖核酸(snRNA)为核酶载体构 响。并设计针对丙型肝炎病毒(HCV)RNA HCV RNA的裂解能力。 l 实验材料 1．1 细胞 肝癌细胞系HepG2．2．15细胞、Huh7细胞由北京人民医院肝病研究室魏来博士惠赠。 1，2质粒 品。 1 3主要试剂 interference RNA干涉试剂盒(LineSileneer”RNA 析试剂Lueiferase Anti-goatIgG(AP)为美国 AssaySystem、蛋白检测用抗体Anti-laeiferasepAb、Donkey ELISA检测试剂盒购于华美生物工程公司，非放射性乙型肝炎病原基因诊断 Promega产品。HB8Ag、HBeAg 试剂盒购于上海医大预防医学研究所。 振兴吉林老工业基地——科技工作者的历史责任 2 实验方法 2．1 siRNA对HBV复制和表达的抑制作用 2 I，l HepG2．2．15细胞的传代与培养 HepG2 380ug／m1)，37℃，5％CO：培养，常规传代及培养。 2．1．2 siRNA表达框架体系(SECt)的构建 以HBV 列或其互补序列)。同时针对一个无关随机序列设计合成下游引物，来构建无关对照的SECs，引物序列为： 上电泳，通过与DNAMarker比较和OD值来估计PCR产物的浓度。 2．1．3 siRNA抗HBV活性检测 解液中的HBV 验孔P／N一对照iLP／N)／(对照孔P／N一2．1)×100％。 2．2 10．23DNAzyme对HBV的抑制作用 2．2．I 10．23DNAzyme的设计合成 设计针对HBV CAACGATCTAAGGC．3 7，对其两端侧臂各5个碱基的磷酸进行硫代化修饰，硫代化修饰与未修饰的 GATICTAAGGC一3’。 2．2．2 10．23DNAzyme的抗HBV活性检测 2．2．2，l lO-23DNAzyme转染HepG2．2．15细胞 2lxg分别 核苷酸作为反义对照。不经任何DNA转染HepG2．2，15细胞作为空白对照。 2．2．2．2 10—23DNAzyme抗HBV活性检测 DNA，检测方法同前。 胞，制备细胞裂解液，斑点杂交法检测HBV 2．3 Ut嵌合体核酶对HCV的抑制作用 2．3．1 Huh7细胞系的维持与传代 常规传代及培养。 吉林省第三届科学