白菜细胞核雄性不育相关基因CYP86MF的克隆和序列分析研究.pdf

园艺学进展(第六辑) 白菜细胞核雄性不育相关基因CYP86MF的克隆和序 列分析 叶纨芝曹家树。 余小林 向 珂 曾广文 (浙江大学蔬菜研究所，浙江杭州310029) 摘要用mRNA差别显示技术对白菜核雄性不育两用系中不育株群与可育株群花蕾总 RNA进行了比较分析。在6种反转录模板和20种差异随机引物共120种组合的选择扩增中共回 收了18个eDNA差异片段，经Northern验证获得了在可育株群中特有的并在花蕾中特异表达的 一阳性差异片段，简称为B0302—4。B0302—4片段经3’RACE和5’端序列PCR扩增，获得了完整的 3’PolyA尾和从起始密码子开始的5’序列，全长1667bp，与拟南芥第一条染色体上编码细胞色素 P450基因CYP86C4核苷酸序列有86％同源性，氨基酸同源率为83％。 关键词白菜}核雄性不育fmRNA差别显示 在高等植物中广泛存在着核雄性不育现象。它是—个很复杂的发育过程，耳前人们对于 植物雄性不育获得的也只是些零星的信息，还没有一个具体的假说能将小孢子发育过程中发 生的生理表现和代谢方式与基因表达很好地结合起来透彻地解释这一现象。白菜核雄性不育 两用系自20世纪80年代育成以来，已在一代杂种生产应用中发挥了重要作用。但是，对其遗 传规律的认识还停留在形态和细胞水平，产生雄性不育的分子基础还不清楚。mRNA差别显 示(Differential mRNA中，有效地鉴别并克隆差别表达的基因。本研究以白菜核雄性两用系可育株群和不育 株群为材料，用DD-PCR技术分析比较了它们的花蕾总mRNA的差别表达，对差异的cDNA 进行了序列分析和Northern验证，获得—个可能与白菜核雄性不育相关的基因，为探讨植物 雄性不育发生的分子机理提供了重要信息。 1材料和方法 1．1研究材料 研究材料是经过多年测交，自交观察测定获得的稳定的白菜核不育两用系，其育性差异为 一对隐性基因控制，是一个可育株与不育株比例为1·1的兄妹交系统，可育株自交后代为 3t 1分离，是仅有一对性状差异(Hp可育与不育)的核不育两用系，是鉴别差别表达基因的一对 稳定的基因型材料。 1．2寡核苷酸引物 P弛．CE中基因特异引物R1 5’一cTCrGACCGTGAAGAGA(玎A一3’，A25-ACAGAACTTGT二 物A1和A2分别为A1 基金项目：国家自然科学基金资助项目。 *为通讯作者。 of Horticulture 注l文中大部分内容巳经在Journal Science＆Biotechnology(2003)78(319--353)中发表． 蔬 菜 B0320购自该公司。 1．3瑚qA提取与eDNA第一链合成及PCR扩增 株的RNA作为不育株群和可育株群的反转录模板。逆转录反应参照M13I公司eDNA第—链 dNTP，100 合成试剂盒产品手册。PCR反应体系为：1×PCR缓冲液，50脚∞I／LngT。：M，随机 s一40℃30 引物40ng，eDNA第—链反应产物2皿，Taq酶1．25U。PcR扩增条件为94℃25 S--72℃1 r11in。 tIlin，反应45个循环后，72℃延伸5 1．4 PcR扩增产物电泳、银染及回收 PeR产物3肚，在6％的聚丙烯酰胺测序胶中电泳分离，凝胶进行银染。具体的银染操作 参照Pramga公司的银染测序手册。eDNA差异片段用针尖挑起，直接进行P(R重扩增，重 扩增条件如RT-PCR(把差异随机引物浓度提高到100 Ilg，复性温度提高到42V)。用glass Inilk DNA回收试剂盒回收eDNA差异片段重扩增产物。 1．5 eD