微生物学目的与要求.docVIP

实验二 细菌生理及外界因素对细菌的影响 目 的 掌握细菌的分离培养技术及纯种移种法。 掌握常用热力灭菌法及紫外线消毒灭菌法。 熟悉细菌各种生长现象及细菌代谢产物及物理消毒法。 了解细菌的常用培养基及生物因素对细菌的影响。 内 容 基础培养基的制备（自学），细菌移种（部分示教及操作） 细菌生长现象（示教） 分离培养方法——琼脂平板划线法（操作） 细菌代谢产物的检查（操作及部份示教） 常用物理消毒方法（操作） 生物因素对细菌的影响（示教） 一、基础培养基制备及细菌移种 基础培养基制备 1．肉汤培养基：肉汤培养基常用瘦牛肉制成，如无牛肉用牛肉膏代替。 【材料】 牛肉、氯化钠、蛋白胨、氢氧化钠、蒸馏水。 【方法】 ① 称除去筋膜无油脂的瘦牛肉500克，用绞肉机绞碎后加水1000毫升，搅拌均匀后放置搪瓷锅内，置冰箱过夜，除去液面上的浮油并使牛肉的水溶性养料充分地渗透出来。 ② 次日取出，煮沸30分钟，用纱布过滤，肉渣中液体应尽量挤净。 ③ 肉汤中加蛋白胨10克，氯化钠5g，搅拌加热使完全溶解，并用蒸馏水补足至1000毫升。 ④ 冷至50℃左右，用氢氧化钠校正pH至7.6左右。 ⑤ 酸碱度调整后，加热10分钟，使肉汤中部分蛋白质及磷酸盐等因加碱与再度加热的影响，而重新凝固沉淀。滤纸过滤，补足失水。重新调整酸碱度。 ⑥ 分装于烧瓶或试管，瓶口或管口加棉塞，包扎后置高压蒸汽灭菌器材内，121℃蒸汽灭菌15~20分钟。冷却，贴好标签，置于燥凉处备用。 注：如用牛肉膏制备肉汤培养基，配方如下： 牛肉膏 0.5g 蛋白胨 1g 氯化钠 0.5g 蒸馏水 100ml 以上各种成份混合加热溶解后，即可调整pH，分装灭菌待用。 2．肉汤琼脂固体培养基制备 加2~3克琼脂至100毫升肉汤培养基内。加热融化，过滤，补足失水，分装于试管中。高压蒸汽灭菌后，趁热将试管斜置，冷凝后即成琼脂斜面培养基。或待冷至50～60℃，以无菌操作倾入灭菌的培养皿中，冷凝后即成琼脂平板。 3．肉汤琼脂半固体培养基制备 ① 加入琼脂0.35克至100毫升pH7.8的肉汤中，加热融化后，用脱脂棉过滤，补足失水。 ② 分装于小试管 (10×100毫米)，每管3毫升。高压蒸汽下121℃灭菌15~20分钟后直立冷凝即成。 （二）纯种细菌接种法 1．斜面培养基接种法（示教） 【材料】 （1）菌种：大肠杆菌琼脂斜面18~24小时培养物。 （2）培养基：琼脂斜面培养基。 【方法】 （1）左手拇指、食指、中指及无名指分别握持菌种与待接种的培养基管（图2－2），使菌种管位左，培养基管位右，斜面部均应向上，勿成水平，以免管底凝结水浸润在培养基表面甚至沾湿棉塞。 （2）右手拇指和食指分别转动两管棉塞，以便接种时易于拔取。 （3）右手执持接种环（姿势与握铅笔似），在火焰中烧红灭菌，欲伸入试管内的接种杆部分亦要迅速通过火焰2~3次以烧去其表面的杂菌。灭菌过的接种环要握持手中，勿再碰及它物。 （4）以右手手掌与小指，小指与无名指分别拔取并挟持两管棉塞，将两管管口迅速通过火焰数次灭菌。 （5）以灭菌并已冷却的接种环伸入菌种管，从斜面上挑取菌苔少许。退出菌种管，再伸进待接种的培养基管，自斜面底轻轻向顶蜿蜒划线或在斜面作上下涂布，慎勿划破培养基表面（图2－3）。沾菌的接种环，进出试管时，均不应触及试管内壁。 （6）接种毕，重新烧红接种环灭菌后放下。两管管口迅速通过火焰2~3次，塞回棉塞并以右手拇、食两指分别将两管棉塞转进至原来位置。37℃孵育18~24小时后观察生长情况。 2．液体培养基接种法(示教) 【材料】 （1）菌种：大肠杆菌琼脂斜面18~24小时培养物。 （2）培养基：肉汤培养基。 【方法】 （1）如斜面培养基接种法握持菌种管及待接种的肉汤管。 （2）接种环灭菌冷却后，伸入菌种管挑取少量菌苔退出菌种管，再伸入肉汤管。在接近液面的管壁上轻轻磨研，再沾少许肉汤调和，使菌混合于肉汤中（图2－4）。 （3）接种完毕，接种环重行灭菌后放下。塞好棉塞，37℃孵育18~24小时后观察生长情况。 3．穿刺接种法(半固体接种法)示教 【材料】 （1）菌种：大肠杆菌琼脂斜面18~24小时培养物。 （2）培养基：半固体琼脂培养基。 【方法】 如斜面培养基接种法握持菌种管及待接种的半固体琼脂培养基。 （2）右手握接种针，灭菌冷却后，以针挑取菌苔。垂直刺入半固体琼脂培养的中心直至接近（但勿触及）试管底，然后循原路退出（图2－5）。 二、细菌的生长现象(示教) 【材料】 1．菌种： 大肠杆菌琼脂斜面18~24小时培养物 枯草杆菌琼脂斜面18~24小时培养物 甲型链球菌血琼脂斜面18~24