磷灰石纳米粒子对肝癌细胞的Cmyc、p53表达的影响研究.pdfVIP

曹献英李世普齐志涛韩颖超 武汉理工大学生物中o，武汉430070 摘薹 目的：研究磷灰石纳米粒子体外对人肝癌细胞系BeI-7402的作用机理．方法：应用均 相共沉淀法室温下合成磷灰石纳米粒子，用透射电镜和电住粒度仪进行表征；利用透射电镜、 原位杂交细胞化学技术检测其对人肝癌细胞系BeI-7402的C-myc和p53基因表达的影响．结 果：磷灰石纳米粒子呈均匀分散的针状颗粒，粒径范围在67．5nm．88．3nm之闻．可使肝癌细 胞体积增大，胞质空泡化，线粒体肿胀：部分细胞核内染色质分散，凝集在核膜周围，呈团 块状，核膜间隙不等，胞浆溶解．抑制C-myc和增强p53基因的表达。结论：磷灰石纳米粒 子在体外通过下调C-myc和上调p53基因的表达，致肝癌细胞胀亡． 关键词磷灰石纳米粒子，癌基因，细胞胀亡 恶性肿瘤是人类的杀手之一，预防肿瘤的发生、控制其发展乃至从体内清除肿瘤，一直 是医学工作者的研究热点．近年来，随着基因技术和纳米技术的发展．二者在抗肿瘤方面的 研究与应用已经越来越广泛”…．我们的实验着重于无机纳米粒子本身的生物学特性，研究其 体外的抗肿瘤作用。羟基磷灰石是人体骨组织的主要无机成分，呈纳米微晶状态。本实验选 取了人工合成的磷灰石纳米粒子，以人肝癌细胞系Be卜7402为作用对象，探讨磷灰石纳米粒 子的体外抗癌作用机理。 1材料和方法 1．1磷灰石纳米粒子的制备均相共沉淀法室温下合成。在一定量ca(oH)：过饱和溶液中加 冷冻干燥器中进行冷冻干燥，收获磷灰石纳米粒子粉末，室温保存。临用前用蒸馏水配制成 1．4mg／ml，行常规高压灭菌，备用． i．2细胞系及其培养人肝癌细胞系Bel一7402来源于中国科学院上海细胞生物学研究所细胞 胞进行实验研究． 1．3粒径及粒度分布铡试将磷灰石纳米粒子超声分散到蒸馏水中，置于铜网上和试样盒内， 基盒项目：湖北省重大科技攻关谭鼍(2001A|05) 作者越舟：t献英(1962-)．血．在读博士．主要从事纳米医学和肿膏细胞生物学的研究． hbcll 通讯作者：李世瞢·男．教授-博导．E-mail：lisp@publicwh 746 Britain)表征纳米粒子的尺寸、品体形貌、分散性，测定粒子的平均粒径及分布等。 1．4透射电镜标本刺备制各细胞悬液，离心成团，加入2．5％戊二醛固定2b，再顺序通过 1％锇酸固定、梯度酒精脱水、树脂浸透、包埋、LKB—V超薄切片，柠檬酸铅和醋酸双氧铀染色， 行透射电镜(T酬)观察． 汉博士德生物工程有限公司)说明书进行，阴性对照组以PBS代替一抗．结果判定：阳性结 果为细胞质中出现棕黄色颗粒． 2结果 2．1磷灰石纳米粒子的表征T酬观察纳米粒子呈均匀、稳定、分散的针状，其平均尺寸为 纳米粒子的比例分别为35．3％和39．7％． 圈l 确灰石蚋米粒子TEMX45K 圈2磷袭石蚺米粒子粒度分布 2．2 TElI观察肝癌细胞超徽结构变化对照组肝癌细胞表面有丰富的徽绒毛，胞核形态不规则， 核膜显示齿状或深凹陷，染色质浓密：胞浆内线粒体、滑面及粗面内质网减少、变形、轻度 扩张(图3)；磷灰石纳米粒子作用72h后细胞体积增大，胞质空泡化，线粒体肿胀；部分细 胞核内染色质分散，凝集在核膜周围，呈团块，核膜间隙不等，胞浆溶解(图4)，呈现细胞 胀亡的变化特点。 田3肝癌细臆TEM×12K 图4辟灰石蚋米粒子作用的肝癌缉囊×IOK 2．3基因表达的改变对C-myc而言，对照组肝癌细胞内可见大量的棕黄色颗粒，充满胞浆。 经磷灰石纳米粒子作用后．颗粒明显减少，几乎消失(图5)．而p53的染色结果恰恰与之相 反，磷灰石纳米粒子作用后棕黄色颗粒反而显著增多(图6)。 747 7戈。 ● 。一h．_：◆ ，f．．．． ．参謦。 ．—●F 二 避臻 铲¨|i J》一 翻5 C．myc原位杂交检测．丑肝癌细胞对照