荧光分析法实验版1.ppt

荧光分析法第一节 概 述 当紫外线照射到某些物质的时候，这些物质会发射出各种颜色和不同强度的可见光，而当紫外线停止照射时，所发射的光线也随之很快地消失，这种光线被称为荧光(fluorescence)。 　　　在紫外光或波长较短的可见光照射后，一些物质会发射出比入射光波长更长的光 荧光。以测量荧光的强度和波长为基础的分析方法叫做荧光光度分析法。 荧光分析法具有灵敏度高，比分光光度法高103~104倍。线性范围宽，方法简便快速且选择性较好等多优点。 近20年来，各式各样新型荧光分析仪不断问世，荧光分析法发展迅速，应用面日益拓宽，尤其是在生物试样的分析及生命科学研究方面（如DNA序列分析等）展现出广阔的前景。 一、荧光的产生 物质分子的能级包括一系列电子能级、振动能级和转动能级。 分子吸收能量后，从基态最低振动能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态的不同振动能级（这一过程速度很快，大约10-15 s），成为激发单重态分子。激发态分子不稳定，可以通过以下几种途径释放能量返回基态。 1. 振动驰豫 2. 内转换 3. 荧光 4. 系间窜跃 5. 磷光 （一）荧光的检测 （二）激发光谱与荧光光谱的形成 任何荧光物质，都具有两种特征光谱，即激发光谱(excitation spectrum)和荧光发射光谱(fluorescence emission spectrum)。 三、影响荧光产生及荧光强度的因素 （一）物质产生荧光的必要条件 第二节 定性定量分析 一、荧光强度与溶液浓度的关系 　　　式中K为常数。因此，在低浓度的情况下，荧光物质的荧光强度与浓度呈线性关系。 第三节 仪器 一、仪器的构造及原理 第五节 荧光分析法的应用 （一） 有机物的荧光分析 （二） 无机元素的荧光分析 （三）在生命科学中的应用  荧光分析测定邻、间-羟基苯甲酸混合物中的二组分析含量 一，目标要求 1.学习荧光分析法的基本理论和操作; 2.用荧光分析法进行多组分含量的测定。 二，原理 某些具有∏-∏电子共轭体系的分子易吸收某一波段的紫外光而被激发，如该物质具有较高的荧光效率，则会以荧光的形式释放出吸收的一部分能量而回到基态。建立在发生荧光现象基础上的分析方法，称为荧光分析法，而常把被测物称为荧光物质。在稀溶液中，荧光强度It与入射光的强度Io、荧光量子效率ψf 以及荧光物质的浓度c等有关，可表示为If=KψfIoεbc。 式中K为比例常数，与仪器性能有关，ε为摩尔吸光系数，b为液层厚度。由此可见，当仪器的参数固定后，以最大激发波长的光为入射光，测定最大发射波长光的强度时，荧光强度 If与荧光物质的浓度c成正比。 在中性水溶液中，邻-羟基苯甲酸（水杨酸）生成分子内氢键（ ）增加分子的刚性而有较强荧光，而间-羟基苯甲酸则无荧光。在PH的碱性溶液中，二者在310nm附近的紫外光照射下则均会发生荧光，且邻-羟基苯甲酸的荧光强度与其在PH5.5时相同。因此，在PH5.5时可测定水杨酸的含量，间-羟基苯甲酸不干扰。另取同量试样溶液调PH到12，从测得的荧光强度中扣除水杨酸产生的荧光即可求出间-羟基苯甲酸的含量。在0~12ug/ml范围内荧光强度与二组分浓度均呈线性关系。对-羟基苯甲酸在此条件下无荧光，因而不干扰测定。 后期作图 1.打开origin软件→　　　→x.txt→找到已保存的文件（两个通道）→Add→OK 点击 →　　　→Add→ →Add→OK。出现光谱图 2.双击X AXTS TITLE，出现对话框，改为x/nm,双击y Ax改为y/F.点击 图标，移动鼠标到峰点，再点T图标，再点左键，输入数值297nm 重复再输入另一峰值 重复输入excitation emission 即成 3.再点击File(电脑左上方) →（save project）点击，输入文件名，点保存。 4．最后点击→Edit(在File后)，点击copy page,即可复制在word文档。 这件完整的图形即可在用U盘拷贝了。 岛津荧光分光光度计 RF-5301荧光分光光度计是由日本岛津公司生产，采用对应的windows工作站直接控制主机，并进行数据处理，在windows的操作环境下，利用鼠标，按键，进行测定，数据分析，编辑和记录等系列操作。采用图表复制功能。能方便地把测定数据集光谱输入、文字处理和表处理软件结合在一起的全自动操作系统。 本光度计的样品室宽大可安装微型样品池，高灵敏度样品池或流动样品池等附件。适用于多种测定采用全息光栅光学系统和数字信号处理使本仪器能达到很高的灵敏度。 岛津荧光分光光度计 一、操作步骤 1.启动RF-5301软件进入RF-5301系统，