实时荧光定量聚合酶链反应快速检测产毒铜绿微囊藻徐恒省，李继影.docVIP

实时荧光定量聚合酶链反应快速检测产毒铜绿微囊藻 徐恒省，李继影，刘孟宇，景明 （苏州市环境监测中心站，江苏 苏州 215004）摘 要：以铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）产毒株微囊藻毒素合成酶基因（mcyA）为靶序列设计了一对特异性引物，运用实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）方法，对铜绿微囊藻进行了定性定量检测。结果表明，仅含铜绿微囊藻脱氧核糖核酸（DNA）模板的样品有扩增，对照组小球藻（Chlorella）没有检测到扩增信号；扩增产物熔解曲线平稳，峰尖且窄，熔解温度为83±1℃，证明该PCR扩增产物极为特异。以重组质粒pMD-18T-mcyA为标准品，所得标准曲线具有高度线性相关，重复性好，符合制备实时定量PCR标准曲线的要求。利用该方法建立的标准曲线对实验室培养获得的铜绿微囊藻DNA样品进行定量检测，与显微镜计数结果基本一致。 关键词：铜绿微囊藻；实时荧光定量聚合酶链反应；微囊藻毒素合成酶基因；定量检测 铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)系单细胞淡水浮游植物，隶属于蓝藻门蓝藻纲色球藻目色球藻科微囊藻属。在我国大部分富营养化水体中，铜绿微囊藻在数量和发生频率上均占优势。由于其生理和生态特性，铜绿微囊藻在适宜条件下，大量增殖并上升到水面，形成水华。铜绿微囊藻水华往往持续时间比较长，控制难度大，对水生态环境的危害也更为严重。另外，铜绿微囊藻的部分种群可以产生微囊藻毒素，其毒性和健康危害已引起全世界的广泛关注。 微囊藻毒素（MC）是蓝藻，尤其是一些微囊藻产生的单环七肽，在爆发蓝藻水华的水体中普遍存在。微囊藻毒素是一种肝毒素，长期饮用含有微囊藻毒素的水，会引发肝损伤甚至肝癌。已经有研究人员考察了在实验室培养中微囊藻毒素在藻细胞和培养基之间的分配过程，结果表明，处于对数生长期的微囊藻培养物中至多能释放10%-20%的毒素到培养基中，大多数毒素依然存在于细胞内。而在自然水体中微囊藻毒素大量释放到水柱中一般出现在水华大量衰亡的季节。因此，直接检测水体中微囊藻毒素的含量无法满足蓝藻水华预警和水质安全控制的需要。 微囊藻毒素是一类受产毒基因调控，在胞内代谢产生的毒素。Nishizawa等利用聚合酶链反应（PCR）技术分离得到多肽合成酶编码的微囊藻脱氧核糖核酸（DNA）片段，发现能产毒的微囊藻都含有多肽合成酶复合体基因簇（mcy），没有mcy基因或mcy基因缺活都不能产生MC。研究发现了11个与微囊藻毒素合成有关的基因，其中微囊藻毒素合成酶基因（mcyA）编码多肽合成酶（NRPS），作用二肽基中间物向七肽基延伸，以及随后肽的环化。微囊藻毒素合成酶基因的分离和功能研究不仅揭示了微囊藻毒素合成的遗传基础，而且提供了准确检测产毒微囊藻的方法。因此，为更深入了解铜绿微囊藻的种群动力学和产毒情况，有必要对该藻的定性和定量检测方法开展研究。 近年来，PCR方法已成为微生物领域重要的检测手段，此基础上发展起来的实时定量荧光定量PCR(Quantitative real-time RCR，qPCR)技术，以荧光标记染料（Power SYBR Green）和熔解曲线为基础，可以用于检测不同的核苷酸序列。因为不同的PCR产物，鸟嘌呤和胞嘧啶所占的比率（GC含量）、片段长度、核苷酸组成不同，因此熔解温度值也不同，所以其熔解曲线也不同。QPCR方法也被用于多种蓝藻藻类的鉴定和定量检测，本研究以铜绿微囊藻为研究对象，以mcyA为目标片段设计了1对特异性引物，以重组质粒pMD-18T-mcyA为标准品作为标准曲线，建立了定量检测产毒铜绿微囊藻qPCR的新方法。有研究表明，一个单细胞的产毒微囊藻，只含有一个拷贝的mcyA。在实验室条件下培养的产毒微囊藻，藻细胞数与mcyA数一致。因此，该方法可用于快速检测水环境中少量的产毒微囊藻，为蓝藻水华快速预警提供技术支持。 1 材料与方法 1.1 实验材料 铜绿微囊藻产毒株（Microcystis aeruginosa，编号为FACHB-905），绿藻门小球藻（Chlorella，编号FACHB-1298），购自中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库。藻种在实验室中用BG11培养基培养至对数期，藻种培养的光暗周期为光：暗＝14h：10h，光照强度2000lx，培养温度为25℃。 1.2 引物设计 在美国国家生物技术信息中心建立的DNA序列数据库（GenBank）中下载微囊藻所有mcyA的序列，将这些序列输入DNAMAN软件中进行多序列比较分析其同源性，进行引物设计和合成，根据微囊藻（编号：AB019578.2）设计引物，引物序列如下：mcyA-F：5-TTTCATCTCCATCGCCGCA-3；mcyA-R：5-GGACTCCCACTTGTTTACCGA-3。 1.3 基因组DN