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柔嫩艾美耳球虫抗药性虫体纯化及mRNA差异显示的研究
中文摘要
球虫病是集约化的养鸡场危害晟火的疫病之一,目前其防治仍不能离开抗球虫药,但药物
饺州过程中不可避免的会产生抗药性.因此,我们选择抗药性这个球虫病防iff中的重要课题进行
研究.采_I{j玻璃纸法进行了柔嫩艾美耳球虫(Ei口eriatenella)的单卵囊感染车¨单孢子囊克隆,
采川过滤、离心分离和DE.52纤维索柱层析系列方法纯化了不同虫株球虫的裂殖子,对不同虫株
的裂殖子进行了mRNA差异显示,进行了实验室球虫抗药性分子检测方法的初步应用。
单卵囊纯化和单孢子囊克隆。JI=}j单卵囊感染技术,对柔嫩艾荚耳球虫卵囊进行了分离纯化,
实验室单卵囊感染26只鸡,饱和盐水漂浮集卵法进行检测,成功率达38%;首次采用单孢子囊克
隆技术,在国内对柔嫩艾美耳球虫进行了克隆,单孢子囊感染35只鸡,10只鸡感染成功,成功
率28.6%。结果获得了遗传上单一的上海马杜霉素敏感和抗药虫株,甘肃地克珠利敏感和抗药的
虫株,该单卵囊分离纯化和单孢子囊克隆技术简单易行。
不同虫株的裂殖子的分离纯化。12日龄的肉用雏鸡,感染1.5×103个卵囊,采用标准分样
筛过滤、离心分离和DEAE-52纤维素柱层析,纯化了2个敏感虫株和2个抗药虫株裂殖子,通
17×10’个,其中
7个,平均每只鸡获得裂殖子6
化,从30只鸡盲肠黏膜中纯化裂殖子1.85×lO
杂质极少,其纯度适用于mRNA差异显示等分子生物学研究.分别分离纯化了柔嫩艾美耳球虫马
杜霉素敏感虫株和抗药虫株5×105个裂殖子。
柔嫩艾美耳球虫敏感虫株和抗药虫株的mRN^差异显示。采用锚定引物和I随机引物,首次对
点杂交鉴定4个片段为阳性,对阳性克隆测序、同源性比较。来自于马杜霉素抗药虫株裂殖予的
线一5蛋白与虫体融解宿主细胞膜、入侵、运动和溢出有关,在第二代裂殖子时期,抗药性虫株该
序列发生转录,而在敏感虫株中沉默。HCDl序列米臼马杜霉索敏感虫株,该片段与柔嫩艾美耳球
86%,没有该表面抗原功能的报道。AGD5片段米白
虫表面抗原16和17序列同源性分别为83%雨1
抗药虫株,EA.D8—2序列来自敏感虫株。通过比较认定这两条序列为新序列,它们所代表的基lj司的
意义尚不清楚。
实验室球虫抗药性分子检测的初步研究。选择在敏感虫株中沉默,抗曲虫株中表达的特异
序列AGD5设计检测引物,采J{}j
1株地
够鉴别马杜霉素抗药虫株羊¨3株马杜霉素敏感虫株(2株对所有药物敏感的不同地理株t
克珠利抗药性虫株):此鉴定结果与鸡体试验的结果一致。说明敏感虫株羽I抗约虫株的在该序列
15杜霉索抗药性虫株。
的筹异发生在转录水平。以卵囊的总DNA为模板PcR方法却不能鉴别敏感雨l
关键词:柔嫩艾美耳球虫;抗药性;纯化:mRNA筹异显示。
Abstract
isolation
and ofEimeriatenellcL
Singleoocyst singlesporneystcloning The infaecesof
oocysts
theehickenswereidentifiedunder aftersaturated
sodiumchloride
microscope solution
floating.Oocyst
was and the
o
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