山羊痘病毒、羊传染性脓疮病毒的检测编制说明.docVIP

广西地方标准《羊痘病毒、羊传染性脓疮病毒的检测 二重聚合酶链反应法》 （征求意见稿）编制说明 一、项目来源和目的，工作概况 1. 项目背景 山羊痘是山羊痘病毒（goatpox virus, GTPV）引起的一种高度接触性传染病，以发热、全身痘疮、结节和死亡为特征。该病危害严重，我国农业部将其列为一类动物疫病。羊传染性脓疮由羊传染性脓疮病毒（orf virus, ORFV）引起的一种接触性、嗜上皮性传染病，侵害绵羊、山羊和野生反刍兽以及人，以在口唇、舌、鼻、乳房等部位形成丘疹、水疱、脓疱和痂皮为特征，呈全世界广泛流行。 由于山羊痘和羊传染性脓疮在临床症状上较为相似，容易误诊，常规血清学试验存在明显的交叉反应。实验室可采用电镜、病毒中和实验、抗原捕获ELISA以及PCR等方法鉴别并区分两种病毒。但是，上述方法在实际应用中尚存在一定的缺陷。例如，电镜观察需要有昂贵的设备，这对于基层单位而言是不可能获得的；病毒中和试验耗时长、操作烦琐，在操作过程中需要活的细胞和病毒，而细胞、病毒的保存需要超低温条件，因此也难以在基层推广；抗原捕获ELISA目前尚未有标准化的试剂盒面市。尽管国内外不少研究者已相继建立了分别检测上述两种病毒的单联PCR方法，但由于需要分别进行操作，这增加了在同时检测两种疫病时的成本和操作复杂性，并增加了污染的可能。 2. 项目来源 本标准为自治区质量技术监督局下达广西动物疫病预防控制中心承担的2010年第二批广西地方标准制定（修订）计划任务项目（桂质监函[2010]342号），编号为2010-2036。 3. 项目目的 对于山羊痘和羊传染性脓疮检测和诊断，目前尚无国家标准，只有《NY/T 576-2002 绵羊痘和山羊痘诊断技术》一项农业部行业标准。但该标准只提供了中和试验、电子显微镜检查和包涵体检查等3种实验室检测方法。其中中和试验和电子显微镜检查不适合在基层单位运用，包涵体检查检出率较低，结果易受干扰，而且也无法区分山羊痘和羊传染性脓疮。与之相比，PCR方法快速、准确、敏感、操作较简便，易标准化，多数基层单位均具备开展条件，易于推广应用。因此本项目尝试编写能同时检测GTPV和ORFV的推荐性地方标准，内容涵盖应用PCR检测GTPV和ORFV的材料准备、操作方法及结果判定方法。 4. 工作概况 从2009年底开始资料信息收集整理工作，确定标准编写目标和依据，同时起草制（修）订广西地方标准项目建议书，积极开展标准的申报。2010年5月下旬接到自治区质量技术监督局下达的地方标准制定（修订）项目计划的通知后，迅速成立标准起草工作小组，确定标准起草编写方案及时间进度表，并积极组织实施。至6月30日已完成标准初稿的编写。至7月30日完成的测试和验证工作。8月15日已按GB/T 1.1-2009《标准化工作导则第一部分：标准的结构和编写规则》要求完成标准征求意见稿的编写工作，9月15日完成意见征求工作，10月15日前完成标准送审稿的编写。 标准起草人员：郑敏、施开创、胡杰、刘棋、李军、陈义祥、陆文俊、莫胜兰、梁媛、屈素洁。 二、标准编制原则 1. 政策性原则 本标准编写过程遵循国家相关法律、法规和国家标准。 2. 先进性原则 以国内外相关文献资料为参考，力求反映最新的科技成果；以国内同类标准的编写方法为基础，对本标准进行规范、充实和创新，使之具有先进性。 3. 经济性原则 本项目为自筹经费项目，因此在本标准编制过程，从获取信息、起草、实验室和临床验证到形成征求意见稿和送审稿的每一个环节，在确保质量的前提下均力行节约，利用有限的经费圆满完成各阶段编写任务。 4. 适用性原则 本标准集国内外GTPV和ORFV PCR检测技术的成功经验，并经实验室和临床验证，且完全按照国家标准的要求编写，内容全面，形式规范，可操作性和实用性强。 5. 协调统一性原则 本标准参照国内相关标准的编写形式和表达方法，力求与国内相关标准的协调统一。本标准通过持续查新，确保内容不与已有的国家标准、行业标准和地方标准重复或相矛盾。 6. 规范化原则 本标准是严格按照GB/T 1.1-2009的要求来编写的。 三、标准主要内容及依据 标准的主要依据是参考有关文献资料，结合我国国情，进行实践研究，并通过试验和验证后，并参考其他资料经室内、室间验证提出。 标准的主要内容是通过二重PCR对临床组织样品或者细胞培养物中GTPV和ORFV进行检测。标准的建立过程主要进行了以下试验： 1. 试剂和材料 1.1 主要试剂 pH 7.2 PBS缓冲液 Taq酶 1.2 毒株和PCR引物序列 分别见表1和表2。 表 试验用毒株及其来源 毒种名称 GTPV GTPV弱毒疫苗毒AV41株 内蒙金宇集团，疫苗分离