空间环境对黑色素瘤B16细胞基因及蛋白质表达的影响研究.pdfVIP

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空间环境对黑色素瘤B16细胞基因及蛋白质表达的影响 耿传营1 向青1 徐梅1 李红艳1 徐波1 郭宇鹏3 房青1 唐劲天2 1.中日友好医院临床医学研究所生物化学一分子生物学研究室,北京,100029f 2.清华大学工程物理系医学物理与工程研究所。北京,100084; 3.清华大学第二附属医院,北京,100049 关键词 空阃科学 黑素瘸B16基因表迭蛋白质表达 空问环境中对生物体影响最主要的因素是空间辐射、微磁场和微重力环境.空间环境有许多不同 于地圊的特性.对生命有多方画的影响.目前.国际空问生命科学对空间环境在整体水平的生物效康研 究较多。细胞水平的研究还处在初级阶段,空问环境影响生物体特别是动物体的作用机制远不清楚.细 生命科学问题的答案必定从细胞中去寻找.细胞承平上的空间生物学研究是空问生物学发展的基础. 基因的表达情况. 一、材料和方法 (一)实验细胞 选择前期实验筛选出的4株空间诱变B16细胞.这4株细胞的编号分别为4 约175km。远地点高度约500km,孰道飞行18d,环绕地球286圈.地面滞留7~8d(数据由中国空间 过模拟搭载时问和卫星配重舱中的温度而获得的B16细胞。 (二)细胞培养 代时用O.25%胰酶消化细胞. ·57· (三)荷瘤小鼠肿瘤组织蛋白表达 常规培养筛选出的空间诱变、野生型和地面组B16细胞,至细胞生长状态良好时,消化细胞.将实 胞接种lo只小鼠.至皮下接种实验细胞的荷描小鼠生存至2周时.处死。分离衙稽小鼠肿瑚组织。利用 4%多聚甲醛固定分离出的荷瘤小鼠肿瘤组织,制成石蜡切片.利用免疫组化的方法检测荷瘤小鼠肿瘤 非免疫血清封闭,室温孵育.⑤滴加适当比例稀释的一抗,孵育.⑥滴加适当比例稀释的生物素标记二 抗.孵育.⑦滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素,孵育。④DAB显色剂显色.⑨苏木素复染, 盐酸分化,氨水返蓝,上行至二甲苯,封片,镜下观察.拍照。⑩:电荷椴合器件(ChBrgeCoupled Pro CCD)采集免疫组化表达信息.利用图像处理软件ImagePlus定孱分析各实验组蛋白表达水平. (四)基因表达检测 步骤如下o 1.1HzoJ法提取实验细胞RNA 温或真空干燥5—10min.然后将RNA溶于DEPC水中.并保存于一70℃冰箱中. 2.mI州A逆转泵 离心管中加入2弘LmRNA、1fILologo(dT)和7肛L 置于冰上冷却‘随后加入5肛L5×扩增缓冲液、5肛L4种dNTP混合液、3弘LAMV、l肛L 行下一步实验. 3.聚合酶链反应 同时扩增出内参照和目的片段产物.具体步骤如下:20芦LPCR反应体系中包括;o.2mLPCR扩增离 心管中加入11.5弘LDEPC水、1.2弘LMgCk、2pL10×扩增缓冲液、o.4肛L O.3肛LTaq 45s和72℃lmin进行后续循环,94C 带;敷据分析,利用图像采集系统拍照,图像分析软件Scion 基因表达的水平. ·58· 寰l ItT—pCR反应引物序列 (五)统计学分析 于0.05认为有最著性差异. 二、结果 (一)荷瘤小鼠肿瘤组织蛋白表达 免疫组化结果表明t与野生螯B16细胞相比。1l A和VEGF表达明显增加,其他细胞两种蛋白质的表达无明显变化(表2、表3). 寰2空问诱变B16细胞荷瘤小曩肿霜组织MehA一^衰达(积分光密度) 注tl值和P担为各蛆与野生组的硅立l检验结果。 寰3空闻诱变B16细胞荷擅小鼠肿钼蛆投VEGF表达《积分光密度I 拄tf值和P值为番组与野生组的礁丘f谊验结果. (二)空间诱变B16细胞基固表达变化 , ·59· 和l—pgds基因袅达增加’ba皿一3基

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