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空间环境对黑色素瘤B16细胞基因及蛋白质表达的影响
耿传营1 向青1 徐梅1 李红艳1 徐波1 郭宇鹏3 房青1 唐劲天2
1.中日友好医院临床医学研究所生物化学一分子生物学研究室,北京,100029f
2.清华大学工程物理系医学物理与工程研究所。北京,100084;
3.清华大学第二附属医院,北京,100049
关键词 空阃科学 黑素瘸B16基因表迭蛋白质表达
空问环境中对生物体影响最主要的因素是空间辐射、微磁场和微重力环境.空间环境有许多不同
于地圊的特性.对生命有多方画的影响.目前.国际空问生命科学对空间环境在整体水平的生物效康研
究较多。细胞水平的研究还处在初级阶段,空问环境影响生物体特别是动物体的作用机制远不清楚.细
生命科学问题的答案必定从细胞中去寻找.细胞承平上的空间生物学研究是空问生物学发展的基础.
基因的表达情况.
一、材料和方法
(一)实验细胞
选择前期实验筛选出的4株空间诱变B16细胞.这4株细胞的编号分别为4
约175km。远地点高度约500km,孰道飞行18d,环绕地球286圈.地面滞留7~8d(数据由中国空间
过模拟搭载时问和卫星配重舱中的温度而获得的B16细胞。
(二)细胞培养
代时用O.25%胰酶消化细胞.
·57·
(三)荷瘤小鼠肿瘤组织蛋白表达
常规培养筛选出的空间诱变、野生型和地面组B16细胞,至细胞生长状态良好时,消化细胞.将实
胞接种lo只小鼠.至皮下接种实验细胞的荷描小鼠生存至2周时.处死。分离衙稽小鼠肿瑚组织。利用
4%多聚甲醛固定分离出的荷瘤小鼠肿瘤组织,制成石蜡切片.利用免疫组化的方法检测荷瘤小鼠肿瘤
非免疫血清封闭,室温孵育.⑤滴加适当比例稀释的一抗,孵育.⑥滴加适当比例稀释的生物素标记二
抗.孵育.⑦滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素,孵育。④DAB显色剂显色.⑨苏木素复染,
盐酸分化,氨水返蓝,上行至二甲苯,封片,镜下观察.拍照。⑩:电荷椴合器件(ChBrgeCoupled
Pro
CCD)采集免疫组化表达信息.利用图像处理软件ImagePlus定孱分析各实验组蛋白表达水平.
(四)基因表达检测
步骤如下o
1.1HzoJ法提取实验细胞RNA
温或真空干燥5—10min.然后将RNA溶于DEPC水中.并保存于一70℃冰箱中.
2.mI州A逆转泵
离心管中加入2弘LmRNA、1fILologo(dT)和7肛L
置于冰上冷却‘随后加入5肛L5×扩增缓冲液、5肛L4种dNTP混合液、3弘LAMV、l肛L
行下一步实验.
3.聚合酶链反应
同时扩增出内参照和目的片段产物.具体步骤如下:20芦LPCR反应体系中包括;o.2mLPCR扩增离
心管中加入11.5弘LDEPC水、1.2弘LMgCk、2pL10×扩增缓冲液、o.4肛L
O.3肛LTaq
45s和72℃lmin进行后续循环,94C
带;敷据分析,利用图像采集系统拍照,图像分析软件Scion
基因表达的水平.
·58·
寰l ItT—pCR反应引物序列
(五)统计学分析
于0.05认为有最著性差异.
二、结果
(一)荷瘤小鼠肿瘤组织蛋白表达
免疫组化结果表明t与野生螯B16细胞相比。1l
A和VEGF表达明显增加,其他细胞两种蛋白质的表达无明显变化(表2、表3).
寰2空问诱变B16细胞荷瘤小曩肿霜组织MehA一^衰达(积分光密度)
注tl值和P担为各蛆与野生组的硅立l检验结果。
寰3空闻诱变B16细胞荷擅小鼠肿钼蛆投VEGF表达《积分光密度I
拄tf值和P值为番组与野生组的礁丘f谊验结果.
(二)空间诱变B16细胞基固表达变化 ,
·59·
和l—pgds基因袅达增加’ba皿一3基
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