绿豆中抗菌肽的分离纯化与表征及其晶体培养研究.pdfVIP

Y 672491 绿豆中抗菌肤的分离纯化与表征及其晶体培养 摘 要 本文是关于绿豆中抗菌肤的分离纯化与表征、抑菌机理的初步分析及其蛋白质晶体结 晶实验的研究。使用硫酸钱分级沉淀、CM-SephadexC-50弱阳离子交换色谱和POROS20HS 高效液相强阳离子交换色谱等分离技术，从绿豆中分离纯化出一个抗菌肤一一非特异性脂 转移蛋白(pnrnsLTPI)。经 SDS、基质辅助激光解吸附/离子化飞行时间质谱 (MALDI-TOFMS)及N一末端氨基酸测序鉴定，pmrnsLTPI均为单一组分。 pnrnsLTPI经质谱鉴定分子量为9292.97Da;SDS电泳结果表明prrrnsLTPI是单 倍体蛋白，具有分子内的二硫键;par-nsLTPl对真菌菜豆根腐病菌 (Fusariumsolan力 、 棉花枯萎病菌 (FUSariU/IIoxysporf)m)、瓜果腐霉病菌 (今thrumaphanidermatum)、 水稻白绢病菌 (Sclerotiumrolfsii)具有明显的抑菌效果;p-nsLTPI对革兰氏阳性菌 金黄色葡萄球菌也具有一定的抑制作用，最低抑菌浓度MIC值为0.06mmol/ml;在水溶液 的环境pm-nsLTPI能与卵磷脂。一十二酸磷脂酞胆碱快速结合，当脂与蛋白的质量比率Ri 达到8时荧光相对强度为120%并且达到平衡;pm-nsLTPIN一末端21个氨基酸序列为N- MTCGQVQGNLAQCIGFLEKGG-21，经序列分析发现该蛋白为一个新的非特异性脂转移蛋白，且 应用CLUSTALW多序列比对软件分析结果表明该蛋白与其他植物来源的非特异性脂转移蛋 白具有较高的相似性。 电镜扫描结果发现pnrnsL丁P1作用于金黄色葡萄球菌后可使菌体细胞膜破损，出现大 小不一的孔洞，内容物溶出，菌体细胞溶解死亡。对pm-nsLTPI抑制金黄色葡萄球菌机制 初步分析结果表明，抑菌机制的重要分子基础可能是非特异性脂转移蛋白具有脂结合活 性、分子结构中存在一个由4个a螺旋组成的疏水空腔结构和。螺旋具有两亲性。 根据CrystalScreen配制了38种结晶缓冲液对pnrnsLTP1进行结晶尝试，确定第3, 6,9号条件有晶体生长;第6号条件即30%PEG4000,0.lmol/LTris-HC1,pH8.5,0.2mol/L Mgcl,，进行优化后得到理想晶体。由x衍射结果所获得的晶胞参数为:键长: a:8.737A，6:9.341A,c:8.745人:键角:。:90.1130C,0:90.1690C，Y:90.4430C。 该晶体正在进一步研究中。 关键词:非特异性脂转移蛋白，分离纯化，表征，抑菌，结晶 Purification,CharacterizationandCrystallizationofa NovelAntimicrobialPeptidefromMungBean ABSTRACT Anovel9-kDanonspecificlipidtransferprotein(nsLTP)withantimicrobialactivitywas isolatedfrommungbean(Phaseolusmungo)seeds,whichwasdenominatedaspm-nsLTPI.The purificationprocedureinvolvedammoniumsulfateprecipitation,ionexchangechromatography onCM-sephadexC-50column,HighPerformanceLiquidChromatography(HPLC)onPGRQS HS-20column. Theactivepeptide印m-nSLTP1)wasamonomerwithintramoleculardisulfidebridges,as wasestimatedfrommassspectrometry,SDSelectrophoresis,N-terminalaminoacid sequenceanalysis.pm-nsLTPIwastestedtohavestronggrowthinhibitoryactivit