虎源流感病毒HA基因克隆、序列分析及其在重组杆状病毒中的表达研究.pdfVIP

第六次全国会员代表大会暨第11扶学术研讨会 虎源流感病毒HA基因克隆、序列分析及其在重组杆状病毒中的表达 高玉伟1夏成柱’王承字1扬松涛1王铁成1侯小强1’2黄耕1邹啸环1 (1军事医学科学院11所吉林长春1300622北京军区军犬繁育训练基地北京102101) 酸；HAB／01 I及 于H5亚型欧亚谱系中国分支中。将pT-HA质粒及杆状病毒转座载体质粒pFastBae1分别用BamH Xho Bae感 受态细菌，在体内进行重组．并经三重抗性与蓝白斑筛选，得到杆状病毒重组质粒Baemid．HA：将 白在重组杆状病毒中获得表达。用感染重组病毒的sf9细胞免疫小鼠，二免疫后2周可诱导小鼠产生1：4-1：16 的血凝抑制抗体。 关键词流感病毒；HA基因；测序：表达 病毒引起的禽流感，而且继1997香港“禽流感”事件后再次山现了H5N1亚型高致病性流感病毒感染人的事 件。研究表明近年来在我国南部流行的H5N1亚型流感病毒对哺乳动物的感染性与致病性日趋增强，2003 毒感染虎的事件，有近80只虎感染，23只虎死亡，泰国政府表示将对所有病虎进行宰杀。KuikenT证实 H5NI流感病毒可感染与虎同为猫科动物的猫并可在猫之间水平传播，用H5NI感染的鸡饲喂家猫同样可 以使家猫发病死亡口1．本研究室曾从发病虎中分离获得流感病毒，并证明该虎源流感病毒对猫具有致病性。 这些研究表明H5N1已对虎等猫科动物构成了威胁，而且这些动物也有可能成为H5N1流感病毒的新宿主 甚至成为“混合器”，为进一步了解虎源流感病毒的基因特点，我们对虎源流感病毒HA基因的序列特点进 行了分析．并对HA基因在重组杆状病毒中的表达特性进行了研究。 l材料与方法 1．1菌株，质粒 1．2细胞与培齐 粉剂一瓶，溶于700ml双蒸水中，补加NaHC03 青、链霉素。 1．3HA基因扩增与克隆 读码框的特异性引物．上游引物中引入BamHI酶切位点，下游引物中引入XholI酶切位点，引物由上海 生工合成。序列如下略： 工作委托上海博亚生物工程有限公司完成。 1065 第六次全国会员代表大会暨第11次学术研讨会 1．4重组转座载体的构建与转座 1分别用BamHI及XhoI酶切后，回收HA基因 将pMDl8．HA重组质粒及转座载体质粒pFastBac 片段及线性化的pFastBac 和IPTG的筛选平板(含庆大霉素、卡那霉素及四环素抗性)，挑取白色菌落，经再次克隆后，提取质粒后 插入的基因片段都会使PCR产物增大。 1．5重组BaemidDNA的提取与转染昆虫细胞 mM mM RNase 离心收集菌体．加入溶液I(15Tfis-HCI，pH8．0，10 A)，重恳后加入 EDTA，100．e／ml l TE溶解。将脂质体及重组质粒(Bacmid．HA)分别与100uGrace’s细胞培养基(无血清、无抗生素)混 双抗的Grace’s细胞培养基，28℃继续培养，至出现细胞病变后，收集细胞。 1．6重组杆状病毒的电镜观察 天冻融后裂解细胞。收集细胞裂解物，经磷钨酸负染，在JEM．1200EXlI透射电镜下直接观察杆状病毒的 形态与数量，以验证转染的效率。 1．7PAGE电泳与蛋白印迹(Western blotting)检测 收集有明显病变的细胞，加入细胞裂解液，按常规方法处理样品后．进行PAGE电泳，并用同样方法 处理野生杆状病毒感染的昆虫细胞作为阴性对照。将SDS．PAGE的电泳产物转移至硝酸纤维素膜上，用 5