蛋白质研究的其他方法.ppt

蛋白质研究的其他方法（2）; 基因的功能研究成为热点，研究的对象即为基因编码的产物—蛋白质，生物功能的主要体现者和执行者。 在所有生命活动中，细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性，这其中必须涉及蛋白与蛋白、核酸的相互作用。 掌握或发明研究相互 作用的方法非常重要。;主要内容;一、酵母双杂交系统yeast two-hybrid system;酵母双杂交系统建立的基础;酵母双杂交技术的原理;酵母双杂交技术的应用;例：用酵母双杂交系统筛选与NifA相互作用的蛋白质。科学通报，2005，50（6）：540-545;实验步骤： 含nifA的诱饵质粒的构建及鉴定 将重组质粒pGBD-nifA转入酿酒酵母PJ69-4A中, 铺于SD/-Trp, SD/-Trp/-Ade, SD/-Trp/-His+3-AT及SD/-Trp +X-Gal+BU平板上, 30℃培养2~5 d. pGBD-nifA转化子在SD/-Trp和SD/-Trp+X-Gal+BU平板上有正常的菌落长出, 但在X-Gal存在下不呈现蓝色, 而在SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-His+3-AT平板上没有菌落长出, 延长培养时间, 仍然呈阴性结果. 这说明诱饵质粒pGBD-nifA不能自动激活报告基因的表达, 对宿主菌也没有毒性作用, 因此pGBD-nifA可以用作诱饵质粒. ;巴西固氮螺菌Sp7基因文库的构建 提取巴西固氮螺菌Sp7的染色体DNA, 用Sau3AⅠ酶切后回收0.5~3 kb的DNA片段； 然后与经BamHⅠ酶切的3个酵母双杂合系统的质粒载体pGAD1-C1, pGAD-C2及pGAD-C3分别进行连接(以确保外源片段的正确阅读), 则构建成3个质粒文库, 分别命名为YSPC1, YSCP2和YSCP3。 ; 巴西固氮螺菌Sp7基因文库的筛选和阳性克隆的鉴定 共转化：将基因组文库YSPC1, YSPC2和YSPC3分别与诱饵质粒pGBD-nifA共转化酵母感受态细胞,从YSPC1, YSPC2和YSPC3三个基因组文库中共分别得到1.4×106, 3×105和3.5×105个共转化子. 筛选阳性克隆：首先将转化产物铺于SD/-Leu/-Trp/-Ade选择培养基上进行筛选, 3个文库转化物中共有168个菌落表现为Ade+；再将Ade+菌落挑出点种于SD/-Trp/-Leu+X-Gal+BU, SD/-Trp/-Leu/-His和SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His这3种不同的平板上进行筛选. 最后, 从3个文库中筛选到对3个报告基因ade2, his3和lacZ均能激活的阳性克隆109个。;再转化：将这109个纯化后的质粒分别与诱饵质粒pGBD-nifA再次共转化酿酒酵母, 在选择性平板上进行鉴定, 结果表明, 只有11个组合可以同时激活3个报告基因的表达。; 阳性克隆的序列鉴定及相互作用鉴定 测序：结果表明这11个克隆属于4个蛋白基因：其中2个含有与转录因子调控有关的PAS结构域，另外1个基因片段含有与铁吸收有关的fhuE基因，另一个是未知蛋白。 相互作用鉴定：载体互换实验和移码质粒构建实验。 已知NifA与PⅡ蛋白(glnB基因产物)有直接相互作用，但本次筛选的阳性克隆中并没有该基因。 （原因：可能是由于我们在用Sau3AⅠ酶切而构建基因文库时, 由于glnB基因(编码区只有336 bp)周围没有合适的Sau3AⅠ酶切位点而没有被包括进去）;酵母双杂交技术的特点;Advantages;Disadvantages;酵母双杂交技术的改进;双报告基因;单倍体酵母的接合;不同的靶蛋白表达载体;其它酵母杂交技术;三杂交系统—蛋白质;（2）三杂交系统—小配体（筛寻小分子药物的作用蛋白）;（3）三杂交系统—RNA （筛寻与已知RNA片段结合的蛋白）;单杂交系统（筛寻与已知DNA结合的蛋白）;反向双杂交系统;核外双杂交系统;细菌双杂交系统;二、Pull-down实验（in vitro）;洗脱 （2）;The Polymeric Immunoglobulin ReceptorTranslocates Pneumococci across Human Nasopharyngeal Epithelial Cells. Cell, 2000, 102:827–837（鉴定）;methods;rCbpA Covalently conjugated to 1 ml of Affi-Gel 15 (BioRad) in 0.1 M MOPS