zj基因工程第6章(重组DNA的方法).ppt

第六章 重组DNA技术; 基因工程的操作过程;DNA的酶切与连接策略重组率;1 DNA的酶切与连接策略 在选择外源DNA同载体分子连接反应的程序时，需要考虑到下列三个因素：实验步骤要尽可能简单易行；连接形成的接点序列，最好能被一定的核酸内切限 制酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段；对转录和转译过程中密码结构的阅读不发生干扰；;同种内切酶生产的粘性末端的连接;同尾酶生产的粘性末端的连接;1.2.1 同聚物加尾法连接(5`突出末端);1.2.1 同聚物加尾法连接(3`突出末端);C 3 ;1.2.2 衔接物连接法;;1.2.3 DNA接头连接法;2 重组率;2.2 提高重组率的方法 提高外源DNA片段与载体的分子比：5 : 1 - 10 : 1； 载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团； 使用同聚物加尾连接技术； 应用柯斯质粒;载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团： ; 基因工程的操作过程;EcoRI;Test Transformation;如何赋于体外连接DNA分子以生命力？;Competent cells and Transformation;第二节 重组DNA分子的转化 和扩增（转与增）;1.2 选择受体细胞的基本原则;⑤安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染。 ⑥能使重组DNA分子稳定存在于细胞中。 ⑦受体细胞在遗传密码子的应用上无明显偏倚性。 ⑧具有较好的转译后加工机制等，便于真核目的基因的高效表达。 ⑨在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。;1.3 常用的受体细胞;2 重组DNA分子导入受体细胞的方法（转）;UPTAKE OF DNA;Competent Cells;A Competent Cell May Take Up One or More Pieces of DNA;感受态细胞(competent cell):当受体细胞处于容易吸收外源DNA的状态时, 就称为感受态细胞。 ;2.1 Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化;;E.Coli bacterium;The growth rate of a bacterial culture is not constant. In the early hours (lag phase), growth is very slow because the starting number of dividing cells is small. This is followed by a time of rapid cell division known as the log phase. The actual length of each phase depends on the temperature at which the cells are incubated. ;;Recombinant Transformation Competent Cell Procedure;Recombinant Transformation Competent Cell Procedure;Recombinant Transformation Competent Cell Procedure;Recombinant Transformation Competent Cell Procedure;Recombinant Transformation Competent Cell Procedure;Recombinant Transformation Competent Cell Procedure;Recombinant Transformation Competent Cell Procedure;Recombinant Transformation Competent Cell Procedure;Recombinant Transformation Competent Cell Procedure;Recombinant Transformation Competent Cell Procedure;;;Transformation procedure;;SCREENING;;;Control plate: Uncut pBluescript plasmid, incubated, and added to competent cells. ;Test Transformation: EcoRI-cut Foreign Gene DNA ligated to EcoRI-linearized pBluescript, then added to competent cells.;Does a white