环介导等温扩增技术及其在食源性疾病检测中的应用.docVIP

精品论文 参考文献 环介导等温扩增技术及其在食源性疾病检测中的应用 程志杰 　　黑龙江省绥化市疾病预防控制中心 黑龙江绥化 152000 　　【摘 要】食源性疾病的主要诱发因素就是食品中的病原微生物，是较为突出的公共卫生问题，因此，对病原微生物进行有效检测是食品安全性的重要保障。本文主要基于环介导等温扩增技术，并对其在食源性疾病中的应用给予探讨。 　　【关键词】食源性疾病；病原微生物；环介导等温扩增技术；微生物检测 　　【中图分类号】R344+.3【文献标识码】A【文章编号】1276-7808（2015）-05-375-01 　　 　　 　　食源性疾病属于公共卫生问题，其主要致病因子就是细菌等病原微生物。在美国的多项研究中，沙门菌、空肠弯曲菌、肠出血性大肠埃希菌等为主要食源性病原微生物。据我国食源性疾病检测局统计结果显示：在最近十年内，由于病原微生物涉及的人数和引发的食源性疾病高达46.4%，其中40.1%为病原体副溶血孤菌，11.3%表现为变形杆菌，9.4%表现为葡萄球菌肠毒素，8.4%表现为蜡样芽孢杆菌，8.1%表现为沙门菌，4%表现为致泄性大肠埃希菌。 　　一、环介导等温扩增技术（LAMP） 　　环介导等温扩增技术属于新兴的等温核酸扩增技术，主要用于基因检测，对于现阶段基因检测中存在的弊端能够给予有效处理。 LAMP技术的应用，主要利用Bst DNA聚合酶，基于不同的靶序列，进而设计出具有特殊性的两种内、外引物，对靶序列上存在的6个独立区域进行特异性识别，进而使循环链置换反应得以启动。在LAMP技术中，在目标DNA上主要集聚着内引物，促进互补链启动的合成，进而产生哑铃状DNA。以自身为模板，此种结构迅速合成DNA，最终得到起始结构茎-环DNA。这样内引物就会交杂在茎-环上，进而在所合成的DNA上，存在一个中间媒介为含有缺口的茎-环DNA，一般情况下，目标序列主要附于茎上。接着利用外引物，促进环状结构在茎末端形成，最后在同一链上，可以形成茎-环DNA混合物，此结构表现为多环的花椰菜形。 　　二、在食源性病原微生物检测中环介导等温扩增技术的应用分析 　　1、检测沙门菌 　　在伤寒和食品中毒中，主要的病原菌之一就是沙门菌，其传播方式为水源、污染食品等。在食物中毒中，比较常见的现象都是由沙门菌引发的。当前所采用的检测方法，在操作方法上均存在易污染性、低灵敏度、费时等缺点，比如传统PCR技术、血清学、生化反应、分离培养等，已经远远不能满足现代流行病学调查和水源及食品的卫生监测要求。近年来，在沙门菌的检测中，部分研究人员已经开始应用LAMP技术，并取得了快速检测。比如，在14种非沙门菌属和猪霍乱沙门菌模板中，将PCR技术与LAMP技术进行对比分析，首先依次10倍稀释猪霍乱沙门菌DNA，最终DNA浓度分布为1fg/u1、10、100和1pg/u1、10、100、1ng/u1。在PCR反应和LAMP反应中分别放入1u1DNA稀释液，对两种方法的灵敏度进行检测，PCR反应在60min内每管可以最低检测到1pgDNA，而LAMP技术在60min内每管可以最低检测到100fgDNA。此外，LAMP的应用可以快速检测出5种生肉中所包含的沙门菌，比如生羊肉、生牛肉、海产品、生鸡肉、生猪肉等，均可以对LAMP技术的特异性进行确认。研究结果显示，对于相同的反应体系，沙门菌具有较好的特异性，检测结果均为阴性的为非沙门菌，这成分说明LAMP的应用可以实现对沙门菌快速有效的检测。 　　2、检测致泄性大肠埃希菌和志贺菌 　　肠出血性大肠杆菌可以引发出血性肠炎，传播方式为经口传播。即使一个国家的卫生条件再好，虽然对肠道传染疾病进行了有效控制，但是由于肠出血性大肠杆菌引发的感染问题依然存在且越来越严重。革兰阴性兼性细胞内致病菌变为志贺菌，临床上多引发痢疾，严重威胁人类的身体健康，尤其影响贫困地区。在对致泄性大肠埃希菌和志贺菌进行检测时，临床上常用的方法为PCR法和细菌培养法。比如在某项研究中，在检测致泄性大肠埃希菌和志贺菌时，LAMP技术的应用，不仅具有较高的灵敏性，还能实现有效快速的检测。以上两种病原菌存在相同的靶基因--ipaH用于扩增反应，仅需要两个小时就可以完成整个检测过程，与PCR法相比，不仅用时短，且最小检测限可以达到8cfu，超过PCR法两个数量级。除此之外，许多研究者将LAMP技术应用于副溶血孤菌、阪依肠杆菌、O1587大肠埃希菌等研究中，均具有较高的特异性和灵敏度。 　　结束语 　　综上所述，在国内突发公共卫生事件中，LAMP技术的应用是非常有力的检测手段，其优点表现为试剂盒属于国产且检测试剂具有较低的成本、对食源性病原微生物具有较高的灵敏度与特异性，在今后多层次疾病预防控制中LAMP技术的应用奠定了坚实的基础。 　　 　　参考文献：