环介导等温扩增技术在我国食源性致病菌检测中的应用.docVIP

精品论文 参考文献 环介导等温扩增技术在我国食源性致病菌检测中的应用 李铭新（沈阳市苏家屯区疾病预防控制中心 辽宁沈阳 110101） 　　【关键词】环介导等温扩增 食源性致病菌 快速检测 　　【中图分类号】RA 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2013）42-0049-02 　　2000年日本学者Notomi在杂志上公开了一种新的适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术，即环介导等温扩增技术，简称LAMP。LAMP技术是在65℃恒温下进行核酸快速扩增，利用两条特异性内引物和两条特异性外引物识别靶基因上的六个区域，其DNA聚合酶具有链置换活性，几十分钟即可完成核酸扩增。该技术要求的设备简单、操作方便、肉眼即可判断结果，且所需时间短、特异性好、灵敏度高，适合基层普及推广，因此受到了世卫组织WHO、各国学者和相关政府部门的关注，国外LAMP技术已广泛应用各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测、食品化妆品安全检查及进出口快速诊断中。 　　1 LAMP技术的特点 　　LAMP反应不需要预先进行双链 DNA 的变性，恒温下即能实现扩增反应，没有因温度循环造成的时间损失。LAMP扩增反应1 h内即可完成。环引物的添加使得时间更缩短到原来的1/2，20 ～30 min 即有扩增产物可被检测。这对于快速诊断十分重要。 与传统PCR 相比，LAMP 能从低拷贝数样品中扩增出目的基因，检测率比传统PCR高出 1～2 个数量级，LAMP法和实时PCR敏感性相同，适用于低拷贝数样品的检测。LAMP法中靶序列的 6 个区域与4条特异性引物均需匹配，否则核酸不能扩增，故特异性极高。LAMP法扩增结果可用肉眼观察浊度或添加荧光染料观察颜色变化来判定，不需要对产物进行电泳，使结果可视化，操作更简单。 　　2 LAMP技术在我国食源性致病菌检测中的应用 　　病原微生物引起的食源性疾病是影响食品安全的主要因素之一,常规食品微生物检测方法包括反复增菌、菌落分离及多种生化和血清学鉴别实验，检测周期长。PCR技术检测成本高，难以应用于现场应急处置及基层普及推广。LAMP技术以其特异性强、灵敏度高、速度快、成本低等已被用于食品致病菌检测的研究。LAMP 将成为可以替代 PCR 的核酸扩增的新技术。 　　2.1在阪崎肠杆菌检测中的应用 　　阪崎肠杆菌是乳制品中近几年新发现的一种致病菌。由其引发的婴儿、早产儿脑膜炎、败血症及坏死性结肠炎散发和暴发的病例已在全球相继出现。在某些情况下，由阪崎肠杆菌引发疾病而导致的死亡率可达40%～80%。我国《奶粉中阪崎肠杆菌检测方法》行业标准建立了阪崎肠杆菌的改进的传统检测方法、普通PCR方法和荧光PCR方法。目前，环介导等温扩增法检测液体乳中阪崎肠杆菌的研究不多，一直以来专家学者希望研究一种能快速检测阪崎肠杆菌的方法。董鑫悦等[1]建立的检测乳中阪崎肠杆菌的 LAMP 方法，操作简便，不需要复杂的仪器，反应过程只需水浴锅即可，以阪崎肠杆菌的 OmpA序列为靶基因，设计特异性引物。优化并建立 LAMP 检测乳中阪崎肠杆菌的方法。结果表明，LAMP 检测阪崎肠杆菌纯培养物的灵敏度为 37 cfu / mL，其灵敏度是 PCR 方法的 10 倍。人工污染阪崎肠杆菌灭菌乳的检测限为43cfu / mL。对 23 株致病菌进行特异性实验，特异性良好。LAMP 引物的设计是针对 6 个区域设计的，特异性强; 由于添加了环引物，使得LAMP 反应时间大大减少。并且对于样品处理方法进行了选择优化，缩短了模板制备的时间，使得整个实验过程能在 2h 内完成。 　　2.2在志贺氏菌检测中的应用 　　由志贺氏菌引起的细菌性痢疾是发展中国家的常见病、多发病，严重危害着人们的健康，尤其是儿童的生长发育，也是发达国家腹泻病的主要病原。目前，食品中志贺氏菌检验标准方法为传统的分离培养法，所需时间长，不适于突发食品安全事件的快速检验。马晓燕等[2] 以志贺氏茵侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)作为靶序列，设计引物,优化Mg2+浓度、Bst酶浓度等反应条件，建立LAMP反应体系。 确定了环介导等温扩增技术检测志贺氏茵的适宜反应条件，马晓燕等[2] 确定Mg2+浓度在0.1～0.5mmol／L时均反应，随Mg2+浓度的增加反应条带的亮度逐渐增加，综合反应结果，选择0.3mmol／L为Mg2+的最适添加浓度；0.3～0.7ul的Bst酶均可支持反应的进行，随Bst酶添加量的增加反应条带的亮度逐渐增加，综合反应结果，反应中Bst酶适宜添加量为0.5ul；选择3ul为最适dNTPs添加量；反应温度对试验的影响不是很明显，60～65℃下都能反应；随着反应