大管蛋白质等电聚焦技术初探研究.pdfVIP

第十七届全国色谱学术报告会及仪器展览会会议论文集 大管蛋白质等电聚焦技术初探’ 李优鑫a，孙小春8，王怀峰8，包建民a,b (a天津大学药物科学与技术学院，天津300072； b天津市药物缓释重点实验室，天津300072) 摘要：毛细管等电聚焦(CIEF)是已知的蛋白质分析中技术中分辨率最大的技术之一，这对于复杂 的生物体系的分析，有着极大的吸引力。但是，与疾病息息相关的具有生物活性的蛋白往往是极其 微量的，而ClEF技术由于样品载样量低，检测灵敏度往往不够。为此，我们试图将ClEF技术拓展 的理论基础，搭建原理，和在蛋白质分析中的初步应用。在优化的条件下，单弧型标志蛋白牛血清 白蛋白和多亚型标志蛋白伴清蛋白均得到了很好的分离，同时0．055 mg／ml的五种变异血红蛋白也得 到了非常好的分离。实验表明，由于载样量的大大提高，WIEF具有比ClEF高很多的检测灵敏度。它 既可用于低丰度蛋白组分的研究，又可直接进行后续的蛋白质鉴定，可作为一种新型的常规的制备 型蛋白质分析技术使用。 关键词：大管电泳；等点聚焦；蛋白质；载样量；检测灵敏度 CIEF具有高效、快速、高分辨率及能实现自动化等特点，常用759m以下的小内径毛细管作分 离通道，故其载样量有限。在复杂的生物体系中，与疾病息息相关的具有生物活性的蛋白往往是极 其微量的，ClEF的载样量又低，往往难以达到对感兴趣的蛋白质进行结构鉴定也需要充足的样品量。 故载样量低成为拓宽其应用领域的技术瓶颈。人们也曾尝试着在内径大于100 lun的毛细管中进行 电泳实验，由于焦耳热影响更为严重，风冷控温、液冷控温、非水微管电泳、电色谱等措施均未能 解决问题。其根本原因是这些方法没有能够从源头上消除焦耳热，使微管电泳技术的实际应用能力 受到很大的限制。在此基础上，我们将毛细管等电聚焦模式转移到大管系统中，采用12009m内径 的石英管作为分离通道，同时将其内部插入毛细管作为内部制冷系统，这样在电泳过程中产生的焦 耳热可以及时原位地被逆向流动的冷却液带走，从根本上消除焦耳热的影响，解决载样量问题，从 而使低丰度蛋白检出和直接进行二维蛋白质鉴定成为可能。 1 实验方法与结果 1．1大管系统的搭建：相对于传统的ClEF来说，本文提出的内制冷大管电泳系统的结 构较复杂，详情见图2和3。 (9)WE支座；(10、11)进、出样毛细管。 图l大管电泳系统的流程图 图2WE制冷系统流程图 1．2大管系统制冷效果的评价 实验条件为：10mM Tris-HC!缓冲溶液，HPMC(w／wy= 1％，pH4．5，分离管路总长侑效长：15／8em，室温制冷水， 流速为g．0 mL／min，在大管电泳两端施加不同的电压并随时从 直流高压电源上读取电流值。通过考察大管系统制冷效果，发 现搭建的带内制冷的大管系统确实能起到制冷的作用，能将 图3大管电泳系统中U和A关系曲线 第十七届全国色谱学术报告会及仪器展览会会议论文集 电泳过程中产生的焦耳热及时带走。 1．3大管等电聚焦方法的建立 在搭建的大管系统上建立WIEF方法，分别以牛血清白蛋白(BSA)和伴清蛋白为模型蛋白， 通过考察电压、样品浓度、进样体积、分离通道长度、两性电解质的浓度及配比、各种添加剂的浓 度等一系列条件，优化大管等电聚焦方法。结果BSA和伴清蛋白都得到了很好的分离和检测。 1．3．1 1．3．2 WBIEF检测牛血清白蛋白 WBIEF检测伴清蛋白 图4大管等电聚焦检测BSA电泳图 图5大管等电聚焦检测BSA电泳图 实验条件：大管分离通道总的唷效长：20／12cm。检测电 实验条件：大管总长／有效长：15／8锄，分离电 0mM 压：37