基于反相色谱的集成化蛋白质分析平台的初步构建研究.pdfVIP

第十七届全国色谱学术报告会及仪器展览会会议论文集 P．H028 基于反相色谱的集成化蛋白质分析平台的初步构建宰 周愿叩，袁辉明咖，孙良亮妒，张丽华扩，梁振a，张玉奎8 4中国科学院分离分析重点实验室，国家色谱研究分析中心，大连化学物理研究所，大连1160231 “中国科学院研究生院，北京，100039 关键词：反相色谱，酶反应器，膜接口，蛋白质 1 引言 在蛋白质组学研究中，与肽段分级相比，蛋白质水平上的预分离更有利于后续的蛋白质鉴定 【l，2】。然而，传统的方法是将蛋白质分离后，收集馏分并进行离线酶解，再将酶解产物经液相色谱 分离后，送入质谱进行鉴定。这种方法不仅需要的样品量相对较多，而且离线酶解费时费力、容易 造成样品损失。此外，也很难实现样品的高通量分离鉴定。因此，构建集成化的蛋白质分析平台不 仅可实现样品的自动化分析，而且还能显著提高蛋白质鉴定的准确性。 本文构建了一种基于反相色谱的集成化蛋白质分析平台。先通过反相色谱对蛋白质进行预分离， 随后通过中空纤维膜接口去除样品馏分中的有机溶剂并调节pH值，再依次进入酶反应器在线酶解。 最后将酶解产物通过反相色谱分离后送入质谱进行鉴定。以牛血清白蛋白为样品，对该平台进行了 初步评价。 实验结果显示了该平台在蛋白质分析方面的优势。 2实验部分 ． 2．1试剂与仪器 XL线性离子阱液质联用仪购自Thermo．Fisher公司． LTQ 2．2膜接口的制作 将醋酸纤维素中空纤维膜穿入离心管中，并将两端通过250 i．d．Teflon管固定。然后，用二 pm 通和韧环将膜与Teflon管夹紧，以防止漏液。 2．3酶反应器的制备 mm 将颗粒填料与29％氨水混合，在40℃反应3h。然后将其填装成2．0i．dxloram的微柱。在室 温条件下，通入5％戊二醛，并反应6h。然后通入5mg／mL胰蛋白酶反应过夜。最后在室温下，通 入25mM NaCNBH3反应过夜。 2．4集成化分析平台分析BSA BSA注入反相色谱柱中分离，通过膜接口进行溶剂调节后进入 整个平台如图1所示。将500ng 酶反应器在线酶解；然后对酶解产生的肽段进行反相色谱分离，最后进行质谱检测。 mm 第一维反相色谱分离条件：色谱柱：C8反相柱(0．3i．d×150mm，5“，300A)；流动相：A： 20-20．01mirb 5％B一80％B，20．01-60min。80％B；检测波长：215nm。 中空纤维膜交换条件：交换液为0．2moi／L pH8．3的NH4HC03溶液，串联的膜1交换液流速为 4mL／min，膜2交换液流速为6mL／min。 ‘重大科学研究计划(2007cB914100)和国家科技支撑计划(2006B√u∞3A07)资助 ¨通讯联系人， 张丽华，Email：—iihuazhant,囝—dictxac．cn 1103 第十七届垒国色谱学术报告会及仪器展览会台议论文集 8．0；室温F酶解。 酶反应器反应条件：样品流速：l“L，mjn：过膜接口后样品pH milll d 1％ 第二维反相分离条件色谱柱：C18反相柱(0．3 x50mm．5u，200A)：流动相：A：0 0 TFA州20，B m／z400-2000，34kV250℃。 70-75rain．40％B-80