大肠杆菌系统工程与生物基化学品研究.pdf

大肠杆菌系统工程与生物基化学品 祁庆生 山东大学微生物技术国家重点实验室250100，济南 微生物的代谢特性非常复杂，每种细胞内都存在着成百上千种不同的代谢途径，每个 代谢途径都有底物、中间代谢物和产物，所有代谢途径又通过共享代谢物交叉、串连在一 起，形成一个极为复杂的代谢网络。随着遗传组成的不同或者环境条件的改变，微生物的 代谢网络会相应发生调节和变化。传统的发酵方法难以实现最优的工业过程。因此，代谢 工程已经发展成为一种最有力的工具去优化微生物发酵的工业过程。代谢工程起始于有效 的细胞分析技术，然后通过基因工程来调节菌株的有效性。微生物代谢工程的目的是：1) 在宿主菌中构建新的代谢途径用以产生原来宿主不能产生的新化合物；2)提高宿主菌底物 利用范围；3)提高整个宿主生物的生理代谢水平；4)消除或减弱宿主中副产品的形成；5) 提高宿主原有产物的产量和产率。 在所有微生物当中，大肠杆菌具有无可比拟的优越性：生长迅速，营养要求简单；是 代谢和生理了解最清楚的微生物；是基因工程方法建立最完全的生物。利用大肠杆菌生产 的各种产品越来越多(表1)。 表1利用大肠杆菌代谢工程生产的生物基化学品 要在大肠杆菌中生产有用的化合物，首先要了解大肠杆菌的底物利用系统，其次要了 解大肠杆菌的代谢调控系统。最后通过代谢调节来提高产物的产率。 大肠杆菌的主要底物是脂肪酸和糖类。这些物质的混合物可以从农副产品，油脂和城 ·37· 市垃圾等废弃物中经过处理得到。脂肪酸的利用和葡萄糖一样，脂肪酸参加代谢前先要活 CoA 化。其活化形式是硫酯脂肪酰辅酶A，催化脂肪酸活化的酶是脂酰辅酶A合成酶(acyl et synthetase)。活化的长链脂酰辅酶A，进入B。氧化(Qial，1998)。在脂肪酸代谢中，FadR et et al，1995；Qi 肪酸生长，而各对应的野生型菌株则不能生长。而过量表达facto基因，可以在细胞内生成 大量的中链脂酰辅酶A，它在量上的变化，调控并改变了脂肪酸代谢调控因子FadR对DNA 转录链的结合，使脂肪酸氧化的下游基因转录并表达，从而解除了FadR在降解脂肪酸p． 氧化过程中的阻遏作用，使中链脂肪酸得以降解利用脂肪酸可以进入脂肪酸B．氧化途径， 菌体可以利用脂肪酸作为供能物质生长。进一步通过半定量RT-PCR的分析检测方法证明 et al，2006o 了此推断(Zhang 糖类的利用存在代谢物抑制作用。碳源进入细菌模式的多样性主要取决于相关的转运 系统。不同的碳源转运系统运输过程最显著的差别就是进入细胞的碳水化合物是否磷酸化。 而在大肠杆菌中葡萄糖的转运及磷酸化是由依赖于磷酸烯醇式丙酮酸盐的磷酸转移酶系统 (carbohydratephosphotransferasesystem，PTs)完成的。在大肠杆菌中，介导葡萄糖进入细 胞从而使PTs系统发挥作用的蛋白是EⅡAglc。其大体的作用机制如下：在混合碳源中，当有 葡萄糖存在时，ERA91。以非磷酸化的形式存在，这种形式的EKAgk能与其他碳源的透性酶结 合，从而阻止了其他碳源(如半乳糖，木糖等)进入细胞，这就是通常所说的分解代谢阻 catabolite 遏(carbon o膜蛋白lI repression，CCRCBol。(由p绍G基因编码)在这个运输系 统中起着关键作用。CordaroJC等人研究了p坫G基因失活的突变株利用混合碳源的情况。在 以葡萄糖加木糖或葡萄糖加阿拉伯糖的培养基中，野生菌株出现葡萄糖一戊糖先后利用的 现象，而ptsa突变株则是两种碳源同时利用，并且消耗糖的速率比野生菌快1倍左右(Qi，et al，unpublished)。这样就提高了PHA的产生速率。 不仅可以解除宿主对其他糖类利用的抑制，也可以解除脂肪酸利用的抑制。提高菌体利用 底物的能力，增加产物的产量。目前我们实验室通过对这些代谢途径的调