大肠杆菌ubiA基因的克隆与表达研究.pdf

研究论文与综述 全国第六届工业生化学术会议 (1999，福建)论文集 大肠杆菌ubiA基因的克隆与表达 吴海玲 张惠展 (华东理工大学生物工程学院，匕海200237) ， 摘要:以E.coliMC41006勺染色体DNA为模板，PCR克隆`t到了编码辅酶Q』。生 物合成的关键酶基因ubiA 将该基因克隆于T启动子下游得到重组表达质粒Pte , 并转化E.coliBL21(DE3) 经异丙基硫代半乳P苛(IPTG)诱牛，该基因在T_Y, 动子带动下，获得了显著表达，为构建产辅}iQ,基因工程菌莫定了民好墓A, 关铃词:巷因ubiA,PCR,丸肠fif菌MC4100,BL21D〔E3)，基因表达 辅酶Q,a,泛Am的一种，在细胞线粒休uku,}链即电了传递系统中起递氢休的件川，i有fi要生 理功能 人体自身不能合成铺酶Q一主要从食物中吸收 近年来，rfi着其药理研究的深人及仪健 功能的开发，越来越被人们所Ti视，已成为一种A i的功能食异 辅酶Qt。的生物合成过程非常复杂，在真核生物和原核,4物的研究友叫二4一}fi.91苯甲酸(Pli B)与聚异戊二烯焦磷酸 (PPP)缩合生成3一聚异戊一烯一4一片苯i)1酸的反应S其T物合成的 秘 限速步骤、催化该反应的4一Fr 苯甲酸聚异戊一烯转移N则是辅PQ，「卜物合成的关IttM “，h! 以克隆其相应的编码基NubtA具有重要意义 在真核生物中该酶被发现是结含在线V%体内19L, 对鼠线粒体的研究表明该400对参与kIL的聚异戊 烯的长iti缺三特异性 弓、对尺肠相11的研究也 有类似结果 『“’，这也哈 卜了某一种属生物的19酶支链的氏度是在rPPP)1物合成的水平少_被lil 节的 Kozuner等人X-IRhodobacterCapsulatusIlsdsAV.I}MPI的研At{记实了这护 故本 1一作从产辅酶Q(11=辅酶Quo)的菌株q7克)raWA3,tPI我们以E.coliMC41001色体DNA为模板 设计r合适引物，采川PCR克隆厂该基因，iT使之6_F.cofdBL21(DE3 中稳定友达 同时该 基因上下游引人了几种内切酶位点 为产辅酶Q4囚断`li卜构建农达f粒提供1良好醉础 材料和方法 ubiA基因的克隆及重组质粒pHA2的构建程序见leil 其余略 2 结果 ‘ 2.1引物的设计与合成 通过查询Genbank,比较7E.ccoliK12UMC4100ubiA的全序列而ixitf引物1fi112,见图 2。 没计的四种酶切位点，可将扩增产物直接克隆上两种质粒pJAJ9(含右R.capsulatus的rxcA 启动子)lei及pNF0(含有R.capsulatus的rz担启动子)了’，便于光合细菌中表达质粒的构建 ‘ BgIII一HindIII或BglII』PEM 联合酶切也可将之克隆于多克隆位点，从而为目的片段的克隆提供 了吏多的酶切位点 其中Ndel位点是利用ATG而设计的，该位点可将目的片段直接克隆于类似 11万 研究论文与综述 全国第六届工业生化学术会议 t1999,福建》论文集 一 ，一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 Z5成 cpsT 二 杀 口监 吕 场侧 谷rr G.cnliMC41009}SMAINIA t-L} F-PCK