超声法细胞破碎过程中聚乙二醇对目标产物释放过程的影响研究.pdf

超声法细胞破碎过程中聚乙二醇对目标产物释放过程的影响 张贵锋 苏志国 0008 (中科院化冶所生化工程国家重点实验室， 北京1 0) 摘要以乙醇脱氢酶{ADH)和乳酸脱氩酶《LDH】为目标产物，利用超声法破碎了酵母细胞，研究 了向细胞悬浮洼中加八聚乙二醇(PEG)对目标产物释放过程的影响．结果表明，破碎前向细胞悬浮 液中加八PEG可以明显增犬ADH、LDH及总蛋白的释放量．同时缩短迭到最大释放量所需时间．PEG 的分子量和浓度对目标产物的释放过程影响也十分显著．与未加入PEG的破碎体系相比，破碎过程 中PEG的存在不但可“加快目标产物的释放速率．而且可眦明显增大目标产物的最大释放量． 关t词：细胞破碎，超声法．聚乙二醇，酵母 1前言 细胞破碎是生物工程下游技术中独特的单元操作。在不同的破碎方法中，机械破碎法如珠磨法、 高压匀浆法和超声法等由于操作简单，成本低而应用较为广泛。但是．长时间的操作及剧烈的破碎 条件容易导致具有生物活性的物质失活，最终目标产物的活性收率较低。园此，为了增加目标产物 的收率，应使目标产物的释放量达到最大，同时，尽量缩短破碎时闻以减少目标产物的活性损失。 为此．人们常常通过改变各种操作参数优化破碎过程，但这种通过改变外部条件的优化操作只能在 一定程度上提高目标产物收率。近来我们研究发现通过改变细胞悬浮液性质的方法优化破碎过程效 果颇佳。本文报道了利用超声法破碎细胞时，在破碎前向悬浮液中加入聚乙二醇对破碎速率和目标 产物释放量的影响。 2材料与方法 2．1细胞 干酵母购自哈尔滨马利酵母有限公司。破碎前将酵母细胞在磷酸缓冲液中悬浮活化30分钟． 离心，将湿细胞重新悬浮在O．05mol／L PBS(pH7．95)到一定浓度。对比实验中，在破碎前向悬浮液内 加入一定分子量的PEG到某一浓度。 2．2破碎方法： VC600．dual lnc．)装有直径为13ram钛制探 超声细胞破碎仪(Model olItput，Somcs＆Materials 头，能将电能转化为高频率的机械振动，在溶液内瞬间产生大量的微小气泡，气泡遇到细胞后剧烈 的聚并过程可破坏细胞的组织结构。通过改变细胞浓度、破碎体积、缓冲液pH、输入能量及脉冲 模式可确定各个参数对破碎过程的影响，优化破碎过程。破碎过程中破碎液通过冰浴冷却。 2．3分析方法 破碎过程中分时取样，将样品稀释lO倍，在19009下离心去除细胞碎片，上清夜用于酶的活 性分析和总蛋白释放量测定。 细胞破碎率测定．通过测定破碎前后单位体积内完整细胞的数量计算。 总蛋白浓度．用Bradford法测定，以牛血清蛋白为基准III。 ADH活性测定．根据文献【2】。 LDH活性测定用改进的阿普尔比一莫顿(Appleyby＆Morton)法m。 3结果与讨论 3．1破碎过程优化 超声法细胞破碎过程中，能量输入越高，破 2 碎时间越长．细胞被破碎的越完全。在预先优化 的条件下，细胞浓度15％(湿重)，脉冲模式50％ 9 (有效破碎时间是总破碎时间的一半)，能量输 6 入120W，ADH和LDH及总蛋白的释放过程如 图1所示。刚开始破碎时，由于完整细胞浓度最 大，因此目标产物的释放速率最大，随着破碎过 3 程的进行．细胞破碎率逐渐增大，目标产物的释 一一一目＼∞自一目_}。_o-【I_【日。。‘L 一『Ig＼flH*屺一=凸，I一一_【目＼j一一置凸《 0 放量增多。随着细胞浓度降低，目标产物的释放 min总蛋白量 速率逐渐降低，如从30min到40 一． ，，Disrup，tlon÷““““，