农杆菌及其瞬时转化技术.pptVIP

农杆菌及其介导的瞬时表达技术 ——生科101 杨鑫 李欣 农杆菌（Agrobacterium) 农杆菌是生活在植物根的表面依靠由根组织渗透出来的营养物质生存的一类革兰氏阴性细菌。 农杆菌的生理形态特征 农杆菌喜欢生活在土壤中，特别是耕种过的田地里，因为经过耕种的土壤疏松，适宜根癌农杆菌生长。 农杆菌的身体呈棒状，有细胞壁，长两到三个微米，有鞭毛生长在侧边，依靠鞭毛运动。 农杆菌的分类 农杆菌主要有两种：根癌农杆菌和发根农杆菌 根癌农杆菌能在自然条件下趋化性地感染140多种双子叶植物或裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。这种病曾在法国、东欧和澳大利亚的葡萄等果树上大面积发生。 发根农杆菌则诱导产生发状根，其特征是大量增生高度分支的根系。 农杆菌介导法的基本步骤 (1)诱导目标植物外植体； (2)构建含有目的基因的质粒； (3)质粒导人合适的农杆菌菌株中及该菌株的活化过程； (4)植物愈伤组织的微伤口处理及农杆菌侵染； (5)共培养及脱菌处理； (6)愈伤组织筛选、分化与植株再生； (7)再生植株及其后代的外源基因及其表达产物的分子检测； (7)转基因第一代的目标性状鉴定。 农杆菌瞬时表达技术的原理 将目的基因插入载体中，转化到根癌农杆菌中，后者经酚类化合物(如乙酰丁香酮)诱导处理，在转录水平激活Vir区基因，真空渗透或注射使农杆菌与植株叶片细胞接触，从而实现T-DNA转移进入植物细胞核。大部分T- DNA 并未整合入植物基因组而是暂时存在于核内并在植物细胞转录、翻译成分的协助下瞬时表达T- DNA 基因, 通常在数小时后即可检测到外源基因的表达, 并在1～2 d 内达到最高值。而少量整合进植物染色体的T-DNA在瞬时表达中不起作用或极为微弱。 具体流程简介 首先获得目的基因序列，将目的基因插入到表达载体中，如pBIl2l、pMOG800等，再转化到农杆菌细胞中。目前常用于介导转化植物的农杆菌有LBA4404、EHAl05、Gv3101、AGLl等菌株。 其次，将含表达载体的农杆菌转接于液体培养基培养至对数生长期，离心收集菌体，加入浸润缓冲液，重悬至OD600值约为0．1～1．5，室温静置2～3 h后用于浸润。 然后用农杆菌渗入法感染植物，用针头在植株叶片上扎两个孔，用无针头的针管注射叶片，依靠压力将菌液注入叶片的叶脉之间。该过程通过酚类化合物起着很大的作用。 技术流程 农杆菌表达检测 瞬时表达的检测一般在注射后几天内进行检测或者进一步分析，检测部位一般为注射部位。不同的柿物在注射后表达量随时间而变化，检测方法也依目的而定，如蛋白表达一般在注射农杆菌2～3 d后，收获注射叶片并进行蛋白提取纯化以及相应的Western blot等分子生物学检测。抗病毒分析等一般在注射后4 d在注射叶片上进行攻毒实验并对其症状进行观察及相应的分子生物学分析。本氏烟转基因16c植株经常作为瞬时表达研究基因沉默或抑制子功能的受试植株，注射后进行局部或者整株分析。绿色荧光蛋白(GFP)或gus基因常作为标记基因辅助显微分析等手段，在整个植株中对瞬时表达过程进行跟踪分析，如分析不同寄主病毒致病性中病毒感染部位，病毒复制，胞间运动，远程运动等 应用 外源基因的瞬时表达是十分理想的研究基因表达调控的实验系统。具体可应用于以下几个方面: 第一、 外源基因表达分析 第二、启动子对基因表达调控的研究 第三、基因沉默研究中的应用 第四、宿主抗性( R) 基因与病原物无毒( Avr) 基因的相互作用研究