分子生物学检验技术第8章.pptVIP

一、设计原理 化学法全程标记 与地高辛标记的探针杂交 加入与碱性磷酸酶结合的 抗地高辛抗体 加入 底物 BCIP/ NBT CSPD 一、设计原理 末端标记 3’-末端标记 5’ 3’ 3’ 5’ 5’末端突出的DNA 5’ 5’ 3’ 3’ 3’末端标记的DNA 完整双链DNA KlenowDNA聚合酶 32p—dNTP 变性 32p末端标记的 单链DNA探针 第三节 分子杂交 一、核酸分子与固相介质的结合 第三节 分子杂交 二、杂交 三、信号检测 紫外交联仪进行核酸固定 第三节 分子杂交 一、核酸分子与固相介质的结合 1.支持介质的类型和性质 2.?核酸分子的转移 3.核酸的固定 二、杂交 1.预杂交 2.杂交 3.洗脱 杂交的基本程序 预杂交： 滤膜在68?C的预杂交（含鲑鱼精DNA） 溶液中水浴1h 杂交： 将变性探针加入杂交溶液，在42?C孵浴8h 二、杂交 二、杂交 洗脱： 滤膜浸入2?SSC和0.1%SDS溶液中，室温孵浴5min，再至预热的0.1?SSC和0.1% SDS中，于42?C孵浴15min；随后滤膜在新配制的42?C预热的0.1?SSC和0.1%SDS溶液中孵浴15min；用2?SSC的溶液短暂漂洗滤膜，将滤膜置于一纸巾上 三、信号检测 （二）非放射性杂化分子的检测 （一）放射自显影 （一）放射自显影 1.直接放射自显影 2.间接放射自显影 三、信号检测 三、信号检测 （二）非放射性杂化分子的检测 　 1.直接检测 　　 2.间接检测 　　 3.显色底物检测 　　 4.化学发光底物检测 　　 5.多探针检测 间接放射自显影 三、信号检测 与地高辛标记的探针杂交 加入与碱性磷酸酶结合的抗地高辛抗体 加入 底物 BCIP/ NBT CSPD 三、信号检测 第四节 核酸分子杂交技术的应用 第四节 核酸分子杂交技术的应用 二、Northern杂交技术 三、原位杂交技术 四、液相杂交技术 一、Southern杂交技术 （一）单基因遗传病的基因诊断 （二）基因突变的检测 一、 Southern杂交技术 第八章??? 核酸分子杂交技术 武汉大学 郑 芳 第八章??? 核酸分子杂交技术 第二节 探针的设计与标记 第三节 分子杂交 第四节 核酸分子杂交技术的应用 第一节?? 核酸杂交的基本原理与分类 第一节????核酸杂交基本原理与分类 第一节?? 核酸杂交的基本原理与分类 二、杂交的基本分类 一、核酸分子杂交的基本原理 第一节?? 核酸杂交的基本原理与分类 单链的核酸分子在合适的条件下，与具有碱基互补序列的异源核酸形成双链杂交体的过程称核酸分子杂交 利用核酸分子杂交检测靶序列的一类技术称核酸分子杂交技术 变性 复性 一、核酸分子杂交的基本原理 MASA液态芯片 MASA技术的原理是用不同的荧光颜色对乳胶颗粒进行编码使之具有检测多个靶分子的能力 二、杂交的基本分类 二、杂交的基本分类 二、杂交的基本分类 二、杂交的基本分类 二、杂交的基本分类 二、杂交的基本分类 二、杂交的基本分类 2.Southern blot 3.Northern blot 4.点杂交和狭缝杂交 5.荧光原位杂交 6.基因芯片 1.菌落杂交 1.菌落杂交 二、杂交的基本分类 DNA片段在琼脂糖凝胶上电泳分离 膜上固定DNA片段 在缓冲液中将标记的探针加到膜上 DNA片段从琼脂糖凝胶上转印到膜上 杂交信号的检测 2.Southern blot 3.Northern印迹杂交 二、杂交的基本分类 4.点杂交和狭缝杂交 DNA样品点到滤膜上 1 变性 2 中和 3 固定DNA 4 与标记探针杂交 5 洗脱与显影 探针DNA 探针标记 变性 将探针加到固定的DNA上 二、杂交的基本分类 5.荧光原位杂交 二、杂交的基本分类 6.基因芯片 二、杂交的基本分类 第二节 探针的设计与标记 第二节 探针的设计与标记 （二）标记方法 （一）探针种类的选择 （一）探针种类的选择 DNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针 一、设计原理 一、设计原理 （二）标记方法 　1.探针标记物的选择 放射性标记 非放射性标记 　 一、设计原理 2.探针标记方法的选择 随机引物标记 DNA缺口平移标记 全程RNA探针标记 化学法全程标记 3′末端标记 5′末端标记 一、设计原理 随机引物标记 DNA模板 引物和模板DNA结合 加入klenow片断、3种 dNTP和1种标记dNTP