微生物与基因工程9.ppt

第九章 微生物与基因工程; 基因工程(genetic engineering)或重组DNA技术(combinant DNA technology);一、基因工程的发展历史; 二、基因工程的基本过程;1.将目的基因与运载体DNA在体外进行重组;1、获取;4、筛选;5、克隆;6、表达;三、微生物学与基因工程的关系;;第二节 基因的分离、合成和定位诱变;制备基因组DNA文库 分离、纯化基因组DNA 条件：温和，在EDTA或SDS等存在下 ↓限制酶部分消化 用蛋白酶K消化细胞、酚抽提 大小不同DNA酶切片段 片段分离：常用蔗糖梯度或电泳分离 ↓ 分别与同样RE消化的载体连接 常用噬菌体载体或质粒载体 ↓ DNA连接酶连接。 导入细胞 进入宿主细胞内培养扩增。 ↓ 筛选鉴定 用分子杂交、凝胶电泳等方法鉴定。 ;理想的基因组文库应包含该生物基因组全部遗传信息。 通常基因组越大需要的克隆数越多，要求库容量也越大。;DNA 文 库;2.从DNA文库中分离目的基因;制备cDNA文库; 分离目的基因 的mRNA 逆转录生成cDNA单链 水解去除mRNA， 合成cDNA双链 水解回折处单链 得到平端双链cDNA;从基因文库中筛选目的基因; 用DNA测序仪测出某一基因的碱基序列，或根据某一蛋白质的氨基酸组成反推核苷酸序列，再用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。 一般先合成短片断DNA，然后再拼接成长片段。;有两种方法：　　　　　①逆转录法：以信使RNA为模板，在逆转录酶的作用下将脱氧核苷酸合成合成DNA(基因)。　　②直接合成法：根据蛋白质的氨基酸顺序推算出信使RNA核苷酸顺序，再据此推算出基因DNA的脱氧核苷酸顺序。用游离脱氧核苷酸直接合成相应的基因。;三 PCR 扩增基因;; 1. PCR扩增原理; (1)变性(denaturation) 加热，模板DNA经热变性，双链被解开，成为两条单链。92~96℃;PCR循环--变性;PCR循环--变性;PCR循环--变性;PCR循环—退火;PCR循环—延伸;PCR循环—延伸;PCR循环—延伸;PCR循环—延伸;PCR整个过程; 2. 来自微生物的耐高温DNA聚合酶; 3. PCR技术的应用;四. 基因的定位诱变（site-directed mutagenesis） ;;2)盒式诱变(cassette mutagenesis);3）PCR定点诱变;第三节 微生物与克隆载体;一、质粒载体; 2. 质粒pBR322的结构特点;氨苄青霉素抗性基因; ; 二、λ噬菌体载体; 控制在使重组DNA为野生型DNA长度的78%~105%之间，否则不能正常组装（头部容纳DNA的量是一定的）。 ;三、柯斯质粒载体(cosmid vector);; ③具有克隆大片段外源DNA的能力。;; 四、M13噬菌体载体; 五、噬菌粒载体;; 六、真生核物的克隆载体; 含有来自细菌质粒 pBR322 的复制起点并携带作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因（ AMPr）。 有来自酵母 2μm 质粒的复制起点以及一个作为酵母选择标记的 URA3 基因（尿嘧啶核苷酸合成酶基因 3 . 这种质粒既可在大肠杆菌中也可在酵母细胞中复制，当重组质粒导入酵母细胞中可进行自主复制，且具有较高拷贝数。 ;复制起始点; 含有来自细菌质粒 pBR322 的复制起点和作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因（ AMPr）和四环素抗性基因（ Tet r ）。 有来自酵母染色体的自主复制序列（ ARS ），作为酵母重组质粒导入酵母细胞中可获得中等拷贝数的质粒。 ;复制起始点; 含有来自大肠杆菌质粒 pBR322 的复制起点和作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因（ AMPr ）和四环素抗性基因（ Tet r）; 来自酵母的 URA3 基因，它既可以作为酵母细胞的选择标记，也可与酵母染色体 DNA 进行同源重组。 这种质粒可在大肠杆菌中复制，但不能在酵母细胞中进行自主复制。一旦导入酵母细胞，可整合至酵母染色体上，成为染色体 DNA 的一部分。 ;复制起始点;2.Ti