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吉 林 省 大学生生物实验技能竞赛比赛科目指南 吉林省大学生生物实验技能竞赛组织委员会Hucker 改良的革兰氏染色法鉴定微生物 一、实验器材 1、设备：显微镜（尼康YS100、YS2-H） 2、材料：酒精灯、接种环、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、载玻片、盖片、擦镜纸、白纸、革兰氏染色液（结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红液）、生理盐水 3、菌种：（1）大肠杆菌；（2）枯草芽孢杆菌 二、实验步骤 1、涂片 取一块洁净载玻片，在载玻片的左、中、右3处各滴加一小滴无菌生理盐水，且均匀分布，用接种环以无菌操作分别从大肠杆菌和枯草芽孢杆菌斜面上挑取少许菌苔于左、右一水滴中，从大肠杆菌斜面和枯草芽孢杆菌斜面上各挑取少许菌苔同置于中间一水滴中，分别混匀并涂成薄膜。 2、干燥 室温自然干燥。 3、固定 涂面朝上，通过火焰2-3次。 此操作目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。 4、初染 滴加结晶紫液，以刚好将菌膜覆盖为宜，染色1-2min，水洗。 5、媒染 用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。 6、脱色 用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。 7、复染 用番红液复染约2min，水洗。 8、镜检 干燥后，用油镜观察，比较。 正确结果：菌体被染成深紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的是革兰氏阴性菌。 三、要求 1、竞赛选题内容应在 2小时内完成； 2、载玻片要洁净无油迹；要用活跃生长期的幼培养物做革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。 3、固定操作中，火焰不宜过热，以玻片不烫手为宜。 4、革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌；脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌；脱色时间一般为20-30s。 5、在显微镜视野下观察出两种菌（大肠杆菌；枯草芽孢杆菌）的形态，在混菌中区分革兰氏阴性菌和阳性菌，并作图。 6、写出实验报告，包括实验目的、原理、器材与材料、实验步骤、结果与讨论。胰蛋白酶比活力的测定 一、实验原理 胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，该酶对于由碱性氨基酸（如精氨酸，赖氨酸）的羧基与其他氨基酸所形成的肽键具有高度专一性。本实验利用胰蛋白酶能催化N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）水解生成N-苯甲酰-L-精氨酸（BA）的原理，进行胰蛋白酶的活力测定。由于BAEE在253nm处的紫外吸收远低于BA，而BAEE在胰蛋白酶的催化下逐渐生成BA，反应体系在253nm的紫外吸收值随之增加，因此可以以⊿A253nm来计算胰蛋白酶的酶活力。 胰蛋白酶的酶活力单位定义（底物BAEE）：在本实验条件下，以BAEE为底物，每分钟使⊿A253nm增加0.001所需的酶量定义为1个酶活力单位。 二、实验器材 1、设备：分光光度计（UVmini-1240）、旋涡混合器（QL-901）、微量移液器。 2、材料：试管、试管架、石英比色皿、记号笔、枪头（1000微升、200微升、10微升）、5mL移液管、吸耳球、擦镜纸、滤纸、洗瓶、烧杯。 3、试剂：胰蛋白酶样品（浓度为mg/mL，体积为Xml，需用Tris-HCl缓冲液（水）自行稀释指定倍数后测定（这里可以指定几个倍数，视实际酶活力而定））、0.05mol/L pH 7.8 Tris-HCl缓冲液、2mmol/L BAEE。 三、实验步骤 1、取多支试管，分别标号为1、2、3、4…等，1号为空白组，其余为测定组，按照表1顺序加入各相关试剂。 表1. 胰蛋白酶活性测定加样程序 试剂/mL 空白组 测定组 0.05mol/L，pH 7.8 Tris-HCl缓冲液 待测胰蛋白酶 去离子水 2mmol/L BAEE 总体积 1.5 — 0.1 1.5 3.1 1.5 0.1 — 1.5 3.1 2、以空白组校正A253nm值至0，测定组中加入底物液BAEE后，立即混合均匀，用比色皿在UVmini-1240分光光度计上测定光吸收值A253nm，同时记录时间。 3、每间隔1min读取A253nm值一次，至6min终止读数。 4、通过调节酶的浓度，控制测定组测得⊿A253nm/min在0.05-0.10之间数据视为有效。 5、计算每分钟平均A253nm增加值即⊿A253nm/min。 ⊿A253nm =【(A6min-A3min)/3 + (A5min-A2min)/3 + (A4min-A1min)/3】/3 四、要求 1、竞赛选题内容应在 2小时内完成； 2、微量移液器在吸取液体时避免平置、倒置等状态，防止液体流入移液器腔体内； 3、微量移液器用后要调至最大量程放置； 4、测吸光度之前要分别用水和样品润洗比色杯； 5、滤纸用于吸干比色