生化试验（吉林大学）Day4~1正交实验.pptVIP

1）将已配制好的三种不同pH的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液于9支试管中按表1要求，进一步稀释至一定浓度。(每种pH值的缓冲液配置3种浓度,共9管) 表1 三种不同离子强度的稀释表 稀释后的缓冲液 浓度（mol/L） 0.2mol/L各种pH的缓冲液的加入量（ml） 去离子水的 加入量（ml） 0.2 10 0 0.10 5.0 5.0 0.15 7.5 2.5 正交实验 表2 因素水平表 因素 水平 A 温度 （℃） B pH值 C 离子浓度 （mol/L） 1 35 2.6 0.10 2 45 4.6 0.15 3 55 6.6 0.2 2) 将离子交换得到的E3用去离子水稀释蔗糖酶液， 使浓度达到50U/ml左右，共计12 ml。 3）另取9支试管，编号1-9，按表3中2、3列的要求， 分别加入上述不同pH不同浓度的缓冲液2ml及蔗糖 酶液（浓度50U/ml左右）1ml，混匀。 4）按表3中第一列的要求，将1-9号试管分别放入相应 温度的恒温水浴中保温10min。 5）另取足量的0.2mol/L蔗糖液三份，分别置于35℃、 45℃、55℃水浴中保温5min（试管中保温）。 6）向1-9号试管中，依次间隔1min（或2min）加入相 同温度下保温过的0.2mol/L蔗糖液1ml，立即记时， 摇匀，放回原来温度的水浴中，准确反应3min。 7）按上述次序和时间间隔，加入1mol/L NaOH液0.5ml， 摇匀。 8）空白管：另取一支“0”号试管，加入50U/ml的酶液 1ml，1mol/L NaOH液0.5ml，摇匀，再加入蔗糖液 （0.2mol/L）1ml及pH4.6 0.1M缓冲液2ml。 9）分别于各管中吸取反应混合物0.5ml，加入去离子 水1.5ml和3ml DNS试剂于血糖管中，放入沸水浴中 准确反应5min，急速水冷后，稀释至25ml，摇匀。 以空白管为参比，测出A540值。 A：温度 B：pH C：浓度 列号 1 2 3 试验结果 Yi：A540 试号 1 35℃ 2.6 0.2mol/L ? 2 35℃ 4.6 0.10mol/L ? 3 35℃ 6.6 0.15mol/L ? 4 45℃ 2.6 0.10mol/L ? 5 45℃ 4.6 0.15mol/L ? 6 45℃ 6.6 0.2mol/L ? 7 55℃ 2.6 0.15mol/L 8 55℃ 4.6 0.2mol/L ? 9 55℃ 6.6 0.10mol/L ? K1 ? T=∑Yi ? ? ? ? ? K2 K3 k1 ? k2 k3 R ? 表3 试验方案、结果及数据处理表 四.数据处理 1）数据记录：将上述试验的结果（9个数据），填入表 4中的Yi项内。 2）数据整理及分析 A.按表4要求，计算出各水平下试验结果总和，即第1、 2、3列上的K1、K2、K3并求出k1、k2、k3和k的R值（极 差）。 B.选出优水平组合：据R值的大小，排出因素显著性的 顺序，比较k值选出优水平组合（即好的试验条件）。 试验结果的计算方法 A因素列 B因素列 C因素列 　K1 y1+ y2+ y3 y1+ y４+ y７　 y1+ y６+ y８ 　K2　　y４+ y５+ y６ y２+ y５+ y８ 　 y２+ y４+ y９ 　K3　 y７+ y８+ y９ 　 y３+ y６+ y９ 　 y３+ y５+ y７ 　k1　　　　K1 ／3　 　 K1 ／３　 　 K1 ／３ 　　 　k2　　　 K２ ／３ K２／３　 　 K２ ／３ 　k3　　　　K３ ／３ K３ ／３　 　 K３ ／３ 　　　　 　R　　 kmax.-kmin. kmax.-kmin. kmax.-kmin. 3）结果及讨论： 由上述数据分析讨论在本实验条件下，温度、pH 值和缓冲液浓度对蔗糖酶活性的影响；求出蔗糖酶的 最适温度和最