生化试验（吉林大学）生化实验报告1.docVIP

一、实验目的： 1、熟悉工作曲线的制作方法及注意事项； 2、掌握 3, 5-二硝基水杨酸（DNS）比色定糖的原理和方法； 3、掌握 Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法； 4、掌握酶蛋白分离提纯的原理； 5、掌握酶的比活力测定及其计算方法； 6、掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定Km的方法； 7、运用正交试验法确定温度、pH值、离子浓度的最适条件。 称量技术： 1、了解电子天平的用途 2、了解电子天平的工作原理 3、掌握电子天平的使用方法 4、掌握电子天平使用前后的注意事项 离心技术： 1、了解离心机的基本原理和用途 2、了解离心机的类型和用途 3、了解离心机的型号和控制版面 4、掌握离心机的使用方法 5、掌握离心机使用的注意事项 层析技术： 1、了解层析技术的基本原理 2、了解层析技术的分类情况 3、了解各种层析技术的原理 4、掌握凝胶层析技术 光谱分析技术： 1、学习掌握紫外可见、荧光、红外光谱分析技术原理 2、了解仪器结构和分类 3、熟练掌握常用仪器的使用方法和注意事项 电泳技术： 1、了解电泳的基本原理 2、了解电泳的类型 3、学习SDS测定蛋白质分子量的原理 4、掌握垂直板电泳的操作技术 5、掌握琼脂糖凝胶电泳的操作技术 6、了解转移电泳的基本原理和操作方法 7、了解双向电泳的基本原理和操作方法 二、实验原理： 1、蔗糖酶的提取： ①酵母菌的基本特征： 单细胞，椭圆形、圆形或柱形。长5-30μm，宽1-5μm。 ②生物材料破碎方法： 机械（匀浆）法 ① 研钵 ② 玻璃或Teflon研棒匀浆器（50mL）Teflon：聚四氟乙烯 先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机高，适用于少量组织和脏器。 ③ 高速组织捣碎机（0.5-1L） 将材料配成稀糊状液，放置于筒内约 1/3 体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 ④ 高压匀质机（XL） 高压下的细胞通过阀门流出时，细胞内外压力同时降低，但由于细胞膜的作用，胞外压力瞬间降至常压，而胞内压力相比之下降低较慢，从而在细胞内外形成压力差，使细胞膜破裂。 优点：快速 ，产热小，对蛋白损伤小，破碎效率高。一次破碎效率可达90%以上 超声波处理法 用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，常在 30 至 60Hz 频率下处理 10-15 分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。 反复冻融法 将细胞在 -20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内的水形成冰粒而剩余的细胞液中盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。设备简单、效率不高，时间长，注意蛋白酶！ 化学处理法 有些动物细胞可采用十二烷基磺酸钠 (SDS)、去氧胆酸钠等细胞膜破坏。 溶胞作用 (酶溶解法) 用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。常用的溶酶有溶菌酶、β-1,3-葡聚糖酶、蛋白酶等。 自溶法 将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。 2、蔗糖酶的纯化： ①酶与蛋白质纯化过程的独有特点： （1）特定的一种酶在细胞内的含量很少……纯化困难 （2）可以通过测定活力的办法加以跟踪……寻找关键 ②酶的纯化方法： 酶的蛋白属性； 两性电离： 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液 pH 条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 等电点 (isoelectric point, pI)： 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的 pH 称为蛋白质的等电点。 大分子(胶体)： 分子量可自1 万至100 万之巨，其分子的直径可达 1～100nm，为胶粒范围之内。 稳定的因素： ?? 颗粒表面电荷 ?? 水化膜 调节酶溶解度的方法；有机溶剂分级沉淀 改变离子强度； 盐析 硫酸铵分级沉淀 （反抽提法） 反抽提法（Back Extraction） 例：E.coli RNA聚合酶 42% - 50% 硫酸铵饱和度时沉淀 通常方法：先 33%再 50% 反抽提法：再 42% 将包含待分离酶在内的多种蛋白一起先沉淀出来，然后再选择适当的递减浓度的硫酸铵溶液来抽提沉淀物。 蛋白从溶液中沉淀析出十分容易，沉淀在溶液中溶解有高特异性。 改变pH或温度； 改酶变在介未电纯常化数之；前 PI也是未知的，pH不宜变化过大，以免失活。Cu,Zn-SOD的纯化可在 70 oC，10 min。 改变介电常数； 有机溶剂分级沉淀：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶