课题2PCR技术.pptVIP

自学提纲： 知识回顾：1.DNA分子的结构（外侧、内侧、基本单位）；2. DNA复制过程和特点；3.PCR技术概念及应用。 基本概念：变性、复性、Taq DNA聚合酶、引物 理解PCR技术的原理 掌握PCR技术的全过程 比较PCR技术和体内DNA复制的异同点。 一、基础知识 （一）、PCR技术的概念 是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百份的DNA拷贝 （二）、PCR技术的应用 遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定 PCR的应用1 PCR的应用2 PCR的应用3 一、基础知识 （三）、 PCR技术的原理 1、体内DNA复制的条件： 2、DNA合成的方向 （1）DNA单链两端的命名 （2） DNA聚合酶的特性 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA链。因此，DNA复制需要引物。 3、DNA复制的前提——是______________用_________________方法 思考：高温使DNA解旋，但普通DNA聚合酶会失活,__________________找到耐高温DNA聚合酶 5、体外DNA复制的条件(PCR 反应的条件) ①DNA模板； ②分别与两条模板链相结合的两种引物； ③四种脱氧核苷酸； ④耐高温的聚合酶； ⑤ 控制温度，但不需解旋酶. 二、PCR的反应过程 以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率 二、PCR的反应过程 （1）变性：当温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解聚为单链。 （2）复性：温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 （3）延伸：温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A，T，C，G)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 （1）PCR循环--变性 （1）PCR循环--变性 （1）PCR循环--变性 （2）PCR循环—复性 （3）PCR循环—延伸 （3）PCR循环—延伸 （3）PCR循环—延伸 （3）PCR循环—延伸 练习：见课课练P79第10题 二、实验步骤： 三、操作提示： 操作提示 1．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。 2．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 3．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀，再将微量离心管放在离心机上，离心约10s，使反应液集中在离心管底部，再放入PCR仪中进行反应。 四、结果分析与评价 1、原理：DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰(图5-11)。可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定。 四、结果分析与评价(了解) 2、具体方法如下。 1）．将样品进行50倍稀释：取2μLPCR反应液，加入98 μ L蒸馏水。 2）．以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计(图5-12)的读数调节至零。 3）．加入步骤1中的DNA稀释液100L至比色杯中，测定260nm处的光吸收值。 4）．根据下面的公式计算DNA含量。 DNA含量(μg/ml)=50 x(260nm的读数)x稀释倍数 五、课题延伸 1、PCR优点： 2、PCR技术的意义 练习 1、书本 2、课课练 练习：见课课练P79第10题 练习：见课课练P79第10题 9 下图为PCR过程的前三次循环的图解，请据图回答： (])请将PCR缓冲液中提供的4种组分填写在图中的方框内： (2)第一轮循环中变性 是指_____________________________；复性 是指__________________________________________________ ； 延伸是指___________________________________________________。 (3)假设PGR反应中的DNA模板为P，第一轮循环的产物2个子代DNA为 Nl，第二轮的产物4个子代DNA为N2，第二轮的产物8个子代DNA为 N3，则Nl、N2、N3中分别含有模板DNA单链的DNA分子 ， __________________、____________________个，若继续循环36次，则N 36中将有——个DNA分子含有模板DNA单链。 (4)N3的8个DNA分子中①②是以N2中的_____________为模板复制而来的，③④ 是以N2中的