生物制药专业实验课件（吉林大学）实验具体操作 二.pptVIP

实验内容 演示 蔗糖酶的纯化(E1，E2) DNS曲线，DEAE装柱 演示内容 透析袋的使用（洗+绑+装水试漏+排气+绑+固定） 血糖管如何混匀（胶塞封口后颠倒混匀5-10次） 柱子如何除死体积 粗的柱子： 用螺旋夹夹死最细的白色乳胶管（胶管尽量放于螺旋夹中间），从柱子上拔下黄胶管。 柱子倒置过来，死体积处加满水；柱子倒置回来，柱子内加满水 观察死体积处是否有气泡(有，反过来，弹) 黄胶管内加满水，在流水过程中插入柱子 连接白色乳胶管和黄胶管下方的枪头 观察有无气泡：无气泡可以装柱，有气泡重复上述操作 细柱子注水就可以。无气泡后用螺旋夹夹死白色乳胶管。 蔗糖酶粗品(E1)的制备： 取出样品,4℃ 8000r/min离心10min,弃沉淀及脂层（先用玻璃棒将脂层拨到一边），用滴管取得无细胞提取液E1（中间层），约量得体积V1=（60-70）mL。取2ml放冰箱保存用于测定酶活和蛋白浓度。 离心机注意事项：预冷和参数调节；配平；转子盖；记录 用过的pH试纸、离心后的沉淀扔到垃圾桶中 2.2 乙醇分级和透析（制E2）： ①调pH值:测E1pH、用稀HAC调pH至4.5(注意少量、慢加、搅匀，防止调过，约2-3滴，用镊子夹住0.5-5的精密试纸在比色板上调)； ②第一次乙醇分级（32%乙醇饱和度） 计算出使E1的乙醇浓度达32%时，所需95%乙醇的体积X1，将E1和乙醇X1，放入冰盐浴（冰放1000ml烧杯2/5, 盐放1勺，再加100ml水）中预冷，在不断搅拌下，缓慢滴加乙醇,4℃ 8000r/min ，离心10min，弃沉淀，留上清！量取上清体积为Vm. ③ 第二次乙醇分级（47.5%乙醇饱和度）： 同上法加入X2（为达47.5%乙醇饱和度时需要补加的95%乙醇的体积），4℃ 8000r/min 离心10min，弃上清，取沉淀！！立刻用10ml 5mmol/L pH6.0的磷酸buffer溶解，装入透析袋（截止分子量一万的），用5mmol/L pH6.0的磷酸buffer透析(用250ml烧杯，buffer浸没透析袋) 两次加入乙醇体积的计算公式为： 第一次：X1*95%=(V1+X1)*32% X1=32V1/63 第二次：X2*95%+Vm*32%=(Vm+X2)*47.5% X2=31Vm/95 DNS比色定糖法工作曲线的制作： ①取8支血糖管编号1-8，按下页表中的顺序和数量加入葡萄糖标准溶液（2mg/ml）、蒸馏水、3，5-二硝基水杨酸试剂，混匀后同时放入沸水浴中准确反应5分钟（注意：一定等沸水浴锅中的水沸腾后再放入试管；别用烧杯，烧杯内不一定沸水），取出后立即用流动的冷水冷却，加蒸馏水定容至25ml，摇匀，测定540nm处的吸光度值。 ②以葡萄糖(mg)含量为横坐标、A540值为纵坐标，画出工作曲线。 装柱流程 用去离子水除死体积（演示过）,关闭夹子 垂直固定柱子 取50ml的5mmol/L pH6.0磷酸Buffer于烧杯中备用 打开夹子，调流速1.5ml/min (量筒+秒表，观察每分钟几滴，补加去离子水，防止流干) 液面距柱子磨砂1cm时加满5mmol/L pH6.0的磷酸Buffer（滴管沿柱内壁加，别太猛，带进气泡） 柱子中余下1/3Buffer的时候加稀释过的柱料（搅匀；一次加不完的用滴管补加至加完到黑色标记） 将烧杯中余下的磷酸Buffer（35ml）放于储液瓶中，用插有枪头的胶塞连接到柱子上，打开储液瓶下方的螺旋夹。 平衡柱子，约35ml（量筒+秒表）,同时连接紫外和记录仪,调试,关闭夹子和设备，别拆。 DEAE52离子交换树脂层析准备（制E3）： 装柱注意事项： 连续加入柱料，柱床以上缓冲液中一直有未沉淀的柱料。 小心干柱。 要求一个同学一直负责柱子，别让它干了，没加柱料以前调流速的时候，补加去离子水或缓冲液；装柱过程中一直补加柱料；加完柱料，加满缓冲液，进行装柱流程7。 同时要求另外一个同学调流速（秒表+量筒）；以及连接紫外+记录仪和调试。 * 透析袋的使用 玻璃棒 250ml烧杯 血糖管如何混匀 液体 实验操作 3,5-二硝基水杨酸比色定糖法工作曲线的制作 试号 葡萄糖标准液 去离子水 3，5-二硝基水杨酸试剂 A540 （ml） （ml） （ ml） 1 0 2.0 3 2 0.2 1.8 3 3 0.4 1.6