内皮细胞的培养.doc

内皮细胞的培养 一：内皮细胞培养基的配制（内皮通用） M199或DMEM 按配方配制 胎牛血清 20% 青霉素 100U/ml 链霉素 100ug/ml L-谷氨酰胺 2mM ECGS（内皮细胞生长因子粗提物） 100ug/ml 肝素钠 20ug/ml (40u/ml) 胰岛素(可不用) 40ug/ml 用0.2um的滤膜过滤除菌。培养基在4度可保存2周，在-20度可保存3个月。 二：培养板，瓶的包被 2%的白明胶溶液（HanKs或培养基配制） 96孔培养板——50ul/孔 24孔培养板——100ul/孔 6 孔培养板——200ul/孔 T25培养瓶——1ml/瓶 T75培养瓶——3ml/瓶 4度过夜（或37度30分钟后4度1小时），细胞加入前弃去明胶溶液。 三：肝窦及肝癌内皮（小细胞）培养基： 胎牛血清 10% 青霉素 100u/ml 链霉素 100ug/ml L-谷氨酰胺 2mM DMEM或M199 按配方配制 微血管内皮细胞的复苏，传代和冻存 复苏： 将细胞冷冻管在37℃水浴中快速震荡溶解，然后将细胞悬液缓慢加入到含有30mlDMEM溶液的50ml离心管中，经 1000rpm离心5分钟，弃上清。加6ml内皮细胞培养基中，接种在明胶预先包被的T25培养瓶中，37℃5%的二氧化碳培养箱中培养，24小时后更换培养基。 传代: 先将T25细胞培养瓶中的培养液弃掉，加入D-HanKs液将 瓶中的培养液清洗干净，弃去洗液并加入胰蛋白酶消化液 3ml（0.1%胰蛋白酶 0.1%的EDTA）。 ↓ 在显微镜下观察细胞形态变化，当大多数细胞（80%）变圆后，加入20ml无血清DMEM培养基，震荡使细胞脱壁。 ↓ 消化后的细胞悬液经1000rpm离心5分钟后，弃去上清，将细胞沉淀悬浮于18ml内皮细胞培养基中，混匀后分种于三个明胶预先包被的T25培养瓶中。 冷冻： 将消化后的细胞沉淀溶解于细胞冷冻液中（胎牛血清加10% DMSO），配制成103细胞/1.5ml浓度，将细胞悬液分装于细胞冻存管中（1.5ml/管），将冻存管放置于-20℃冰箱中24小时后移入液氮中。 免疫细胞化学 基本原理： 免疫细胞化学是在细胞化学技术的基础上，吸收免疫学的理论和技术发展起来的一项技术，其基本原理是用荧光素或酶等标记物或显色物标记特异性抗体，通过免疫学中的抗原抗体反应与细胞内的相应抗原结合，形成带有荧光素或显色物的抗原抗体复合物，因此可用荧光显微镜或普通光学显微镜观察到复合物的存在，达到检测细胞内抗原物质的目的。细胞免疫化学是一项综合性技术，包括标本的准备（制备，储备，固定），染色方法以及结果的分析判断，非特异性染色的减轻，消除等。 实验材料： 细胞载玻片（96孔），上海玻璃片厂 细胞抗原，各种待检细胞 第一抗体，杂交瘤上清及免疫多抗 第二抗体，生物素化马抗小鼠IgG(H+L)， vector生产， 辣根酶标记链亲合素， vector生产 第二抗体购自中山公司 DAB, 购自中山公司 马血清封闭液，购自中山公司 30%双氧水，国产 本院领取 无菌细胞刮子 本室自制 PBS 实验步骤： 细胞点片的制备： 细胞载玻片洗液泡30分钟，自来水洗干净，过三次蒸馏水，绸布擦干，于95%乙醇保存待用。 待测细胞（细胞抗原）用刮子轻轻刮下，用PBS洗三次 配成500万/ml（PBS稀释），按1万/孔进行点片（2ul/孔）。 以上细胞点片后吹干（超净台中吹2小时以上）。 -20℃丙酮固定30分钟，吹干，密封4℃保存（干燥器内）。 单抗的测定： -20℃丙酮固定后的细胞点片 ︱ PBS洗一次 ︱ 3%双氧水（PBS配制）在染缸中去除内源性过氧化物酶（15分钟）。 ︱ PBS洗三次 ︱