积雪草酸对糖尿病心肌病心肌细胞VDAC的表达及Ca2+超载的影响.docVIP

精品论文 参考文献 积雪草酸对糖尿病心肌病心肌细胞VDAC的表达及Ca2+超载的影响 毛俊倩 张国辉*(通讯作者) 周艳芳 王好 韩尧辉 潘皓 黄燕 (山西医科大学第一临床医学院 山西太原 030001) 【摘要】 目的 探讨积雪草酸(asiatic acid，AA)对高糖环境中心肌细胞线粒体电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channel，VDAC)的表达和Ca2+超载的影响。方法　将培养72小时的SD乳鼠心肌细胞随机分为三组：正常对照组(5mmol/L GS)、高糖培养组(25mmol/L GS)、高糖+AA组(25mmol/L GS+10、20、40、80nmol/L AA)，继续培养24小时后，Western blot法检测VDAC表达变化；WST法测定心肌细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性，比色法测定细胞内丙二醛(MDA)含量；流式细胞仪检测心肌细胞内Ga2+含量。结果　与对照组相比，高糖培养组心肌细胞线粒体VDAC表达量及SOD活性明显降低(P＜0.05)；细胞内Ca2+及MDA含量显著升高(P＜0.05)。加入AA处理后，VDAC表达量及SOD活性明显上升(P＜0.05)；细胞内MDA含量及胞内Ca2+含量显著降低(P＜0.05)；SOD活性与VDAC表达量呈正相关而与细胞内Ca2+呈负相关；MDA含量与VDAC表达呈负相关而与细胞内Ca2+呈正相关。结论　AA可能通过减轻线粒体氧化应激而提高线粒体VDAC表达量进而减轻细胞内Ca2+超载。 【关键词】 积雪草酸 VDAC表达 Ca2+超载 糖尿病心肌病 积雪草酸(asiatic acid，AA)是富含于中药积雪草中的五环三萜类化合物，具有促进成纤维蛋白合成[1]，抑制肝脏纤维化[2]，抗肿瘤[3]等作用。最近有研究显示AA能够改善高糖对大鼠心脏线粒体的损伤作用，调节氧化还原平衡[4]。当心肌细胞长期处于高糖环境中时，心肌细胞Na+-K+ATP酶活性明显降低从而导致细胞Na+-Ca2+交换受限，并且减少了线粒体对Ca2+离子的摄取造成细胞内Ca2+超载，导致细胞损伤。线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)是线粒体膜通透性变化的主要调节结构，VDAC是MPTP的重要组成成分，在高糖诱导的活性氧(ROS)水平增加的影响下对Ca2+的循环发挥调控作用。所以我们推测AA可以通过降低高糖诱导的ROS生成，减少VADC的异常开放，进而减轻细胞内Ca2+超载而保护心肌细胞，并通过体外实验加以证实。 1 实验材料及方法 1.1实验材料 出生1-2天内的SD乳鼠，由江苏大学实验动物中心提供。积雪草酸(美国sigma公司)；DMEM培养基(美国gbico公司)；胎牛血清FBS(Hyclone公司)；Fluo-3AM钙离子荧光探针、SOD、MDA检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)；兔抗鼠VDAC抗体(美国CST公司)；未特殊注明试剂均为进口分装或国产分析纯。 1.2实验方法 1.2.1 原代心肌细胞培养 新生的SD乳鼠，无菌条件下取出心脏，0.08%胰酶反复消化至组织完全溶解，收集消化上清于DMEM培养基中，1200r/min离心5分钟，弃上清，重悬细胞于含10%FBS DMEM培养基中，CO2培养箱培养，1.5小时后差速贴壁法去除成纤维细胞，隔天换液一次。 1.2.2 心肌细胞分组及处理 培养72h的心肌细胞分3组，对照组加含10%FBS低糖DMEM2ml；高糖组加入含10%FBS高糖DMEM2ml；AA处理组积雪草酸终浓度分别为10、20、40、80nmol/L；继续培养24h后，提取心肌细胞蛋白，BCA法测定蛋白含量。 1.2.3 心肌细胞SOD活性及MDA含量检测 SOD活性检测、计算及MDA含量检测均按照试剂盒说明书方法进行。SOD酶活力单位=抑制百分率/(1-抑制百分率)units。 1.2.4 Western blot法检测VDAC蛋白表达 提取心肌细胞蛋白后，BCA法测定蛋白含量，等比例加入5times;SDS上样缓冲液，每孔上样20ul，行SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS)，以80V电压1.5h，将蛋白转至PVDF膜上，TBS-T液漂洗3-5次，5%脱脂奶粉室温封闭2h；一抗孵育(VDAC稀释度1:1000，抗beta;-肌动蛋白抗体1:15000)，4℃过夜； TBS-T漂洗3次，二抗孵育(山羊抗兔-HRP1:10000，山羊抗