生物化学实验-东北大学生命科学与健康学院.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 五、结果与计算——实验数据记录表 用各管平均A值（吸光度）绘制标准曲线图 测定次数 各管A值（吸光度） 1 2 3 4 5 6 1 2 3 平均值 五、结果与计算 把在标准曲线上查得的NaNO2含量代入正式计算硝酸还原酶活性： NR活性[NaNO2 (μg)/鲜重(g)?小时]＝ 式中稀释倍数对于活体法，指酶促反应液体积（10 mL）与显色取用体积（2mL）之比，即等于5。 附注： （1）无机磷对硝酸还原酶活力有促进作用，因此常用磷酸缓冲液。 （2）活体法酶促反应在暗条件下进行，以防光照下叶绿体形成还原型铁氧还蛋白，促使亚硝酸还原酶把NO2还原成NH3。 （3）提取缓冲液中加入半胱氨酸为的是保护酶分子中的巯基使之不易失活。 1．测定硝酸还原酶依据的原理什么？ 2．测定硝酸还原酶的材料为什么要提前一天施用一定量的硝态氮肥，并且取样应该在晴天进行？ 3．测定硝酸还原酶活性的离体法和活体法各有何特点？ 4．提取缓冲液中为什么加入半胱氨酸？ 思考题： 实验九 凝胶层析法分离提取1,5-二磷酸核酮糖羧化酶 东北大学生命科学与健康学院 一、目的 掌握凝胶层析法原理； 学习用凝胶层析法分离提取1,5-二磷核酮糖羧化酶的操作方法和实验技术。 二、原理 凝胶层析，又叫分子筛层析，是一种液相层析，机理是分子筛效应。凝胶层析是指混合物（溶液）随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，混合物中各种物质因分子大小不同而被分离的技术。其中的流动相一般是缓冲液或其它特定的溶液，固定相是一类具有三维空间多孔网状结构的物质，如葡萄糖凝胶、琼脂糖凝胶等。 适用于蛋白质纯化，蛋白的浓缩和脱盐，被广泛用于蛋白质的分离纯化中。 二、原理 分离原理：当含有各种物质的样品溶液缓慢流经凝胶析柱时，各物质在柱内同进行着两种不同的运动，垂直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子物质由于直径很大，随洗脱溶液一起移动，所以向下移动的速度较快；较小分子量的物质既可以在凝胶颗粒间隙中扩散，还会进入到凝胶颗粒的微孔中进行扩散，因此使得小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使得样品的物质按分子量的大到小顺序流出柱外而得到分离。分离效果常用洗脱曲线表示。 二、原理 本实验中采用的葡聚糖凝胶，是凝胶层析法中使用最广泛的一类层析凝胶，商品名称：Sephadex。其基本骨架是葡聚糖，它是由右旋葡萄糖残基通过α－1，6糖苷键连接而成，葡聚糖分子之间通过醚桥（甘油基）交联形成三维空间网状结构；不溶于水，亲水性很强，由于它的分子中存在许多羟基，在水中吸水形成凝胶并剧烈膨胀，从而能起分子筛的作用，以此来分离不同分子量的物质。 　 本实验用凝胶层析法分离提纯1, 5-二磷酸核酮糖羧化酶，该酶是光合作用中的重要酶系，其分子量约为5×105-6×105，由大小两种亚基组成，在叶绿体中1,5-二磷核酮糖羧化酶（RuBp羧化酶）含量很多，约占叶绿体间质蛋白的50%以上。 三、实验材料、仪器、试剂 实验材料：菠菜叶 仪器：1、Sephadex凝胶层析柱1套 2、组织捣碎机一台 3、离心机一台 4、自动收集器一台 5、紫外检测仪 6、恒温水浴一台 7、不锈钢剪刀一把 8、蠕动泵一台 9、天平 10、纱布 11、硅胶管 12、橡胶管 13、100mL量筒一支，5mL移液管一支，1mL移液管2支，100mL、250mL、500mL烧杯各一支 试剂 （1）Tris-HCl pH7.4(包括两种) ①缓冲液A：内含0.05mol/L Tris-HCl，1.0mol/L NaCl，1mmol/L EDTA，0.002mol/L MgCl2，0.08mol/L β-巯基乙醇。 ②缓冲液B：内含25mmol/L Tris-HCl，0.2mol/L NaCl，0.5mmol/L EDTA （2）(NH4)2SO4 （3）Sephadex G50 四、实验步骤 1．粗酶提取液的制备 (所有学生分四组) 取无病新鲜菠菜展开叶50g，洗净后用滤纸吸干水，剪碎，加入缓冲液A 100mL，用组织捣碎机捣成匀浆，用4层纱布挤压过滤，滤