组织工程化人工骨构建的细胞实验.docVIP

精品论文 参考文献 组织工程化人工骨构建的细胞实验 曲志强 刘海霞 陈微微 兰荫梧 魏东岩 刘思佳 （内蒙古通辽市医院骨三科 内蒙古通辽 028000） 【中图分类号】R68 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）03-0377-02 组织工程的完成，必须具备三个基本条件：①种子细胞的筛选和体外分离培养；②支架材料；③种子细胞与支架材料、生长因子复合构建组织工程化组织。本实验在前期工作中已成功地从体外分离培养出了骨髓基质细胞，作为种子细胞。 1 实验材料及细胞培养 1.1材料 1.1.1主要设备及仪器 FormaCO2培养箱，超净工作台，OLMPUS倒置相差显微镜，37℃水浴恒温震荡器，电子天平，酶连免疫检测仪，电热鼓风干燥器，蒸馏器，荧光显微镜，图像分析系统，扫描电镜。 1.1.2主要试剂 培养基DMEM，胎牛血清,Ficoll淋巴细胞分离液，PBS缓冲液，地塞米松、beta;－甘油磷酸钠、维生素C、四环素盐酸盐，青霉素，链霉素，胰蛋白酶及L-谷氨酰胺，碱性磷酸酶试剂盒等。 1.1.3实验动物 健康成年新西兰家兔五月-六月龄，购买于广东省实验动物中心, 体重2.5kg-5kg。 1.2骨髓基质细胞的原代培养 取两月龄的新西兰大白兔，雌雄不限，3％戊巴比妥钠耳缘静脉麻醉（30mg／Kg），用8%硫化钠将双侧股骨大转子部位褪毛后，常规消毒，铺无菌洞巾，无菌条件下自左右两侧股骨大转子上部用18号穿刺针各抽取骨髓3ml，与36 ml含体积分数10%胎牛血清(FBS)和青霉素及链霉素(Hyclone,美国)的alpha;-MEM培养基 (Gibco-Brl,美国)混匀,接种于100 mm培养皿,每皿10 ml,置于37deg;C、体积分数5%的CO2培养箱中孵育。倒置相差显微镜下逐日观察。3 d后半量换液,1周后完全换液。以后每周更换培养液两次培养至12d时,贴壁细胞近90%汇合,吸净培养基,以PBS冲洗两遍,每皿加入1.5ml质量浓度为0.5g/L的胰蛋白酶(含0.2g/LEDTA),置培养箱孵育5min。 1.3骨髓基质细胞的传代培养 原代细胞培养3 d后半量换液,1周后完全换液, 以后每周更换培养液两次，培养至10～12d，倒置相差显微镜下观察细胞接近融合为单层（贴壁细胞约占培养瓶底80％）后，吸净培养基,以PBS冲洗两遍,每皿加入1.5 ml0.25％胰蛋白酶对原代细胞进行消化2～3分钟，显微镜下观察见到细胞核开始回缩，细胞已开始变形后，立即加入9ml含有血清的培养液终止消化。并用吸管对培养瓶底的细胞进行反复吹打，使之逐渐脱壁，制成单细胞悬液后，加入新的培养液按1∶1比例接种于新的培养瓶进行第一次传代。仍置于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱内培养。24h后加入条件培养液（原培养液中加入beta;-甘油磷酸钠10mmol／L，地塞米松10-8mol／L，抗坏血酸50mu;g／L）。每3d换液一次，相差显微镜下逐日观察。传代成功后约5～6d传代细胞接近融合为单层，再按上述方法消化传代进行下代细胞培养。共传至第3代，加人PBS和含有血清的培养液终止消化并吹打成单细胞悬液，备用。 1.4骨髓基质细胞的形态学观察 在倒置相差显微镜下逐日观察细胞生长、增殖及形态特征的变化。 1.5碱性磷酸酶染色 更换培养液12d后将各组爬满细胞的盖玻片取出，采用钙钴法测定。 钙钴法的主要理论根据是利用beta;－甘油磷酸钠为底物，用Ca2＋和Co2＋捕获磷酸，再用硫化铵处理可形成硫化钴或硫化铅黑色终产物，沉淀在细胞所表达的部位就呈现出明显的黑色。因此阳性染色为黑色。染色后光镜下，每组任取一张染色盖玻片，在10times;物镜下，任计500个细胞计算阳性率；同时每组取6个标本，各组每一染色标本在10times;物镜下随机选取5个视野，每一视野用Image－Pro Plus图像分析系统测量染色区域的总面积值和平均光密度值，然后求它们的乘积，5个视野的平均值就代表这一染色标本的染色阳性均值。 1.6骨髓基质细胞培养 接种后36～48 h,细胞开始贴壁,培养5 d,低倍镜下可见多个细胞积聚成团;8d细胞进一步贴壁生长,细胞成纺锤状及不规则三角形,有长短不同的突起。此后细胞进入迅速增殖,直至10d,细胞贴壁于整个培养瓶,细胞相互融合,达70%～80%的融合率