G3单克隆抗体亲和色谱柱的制备及初步应用研究.pdf

LC-036 G3单克隆抗体亲和色谱柱的制备及初步应用 黄 听 邱宗荫’ 重〔庆医科大学中心实验室 重庆 400046) 1 前言 G，是粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子((GM-CSF)的C端直接与白细胞介素3(IL-3)的N 端连接构建并在大肠杆菌((E.coli)中高效表达得到的重组人GM-CSFAL-3融合蛋白，能刺 激造血细胞的增殖、分化和调节免疫应答。G,的生物学活性与GM-CSF和IL-3相比有显 著提高川.临床上，G。可用于治疗造血功能障碍性疾病。利用基因工程技术生产G。具有 产量大、获得容易等特点，但因产物中含有一定量的菌体蛋白，因而在使用上受到限制。 提高G,的纯度是基础研究和临床应用的关键.我们在成功制备抗G,单克隆抗体(MG) 的基础上，将其定向偶联于rProteinA-SepharoseFF上制备了G,单抗亲和色谱柱MG- rProteinA-SepharoseFF，并用它进行了纯化G,的研究。 2 材料和方法 2.1抗G:单克隆抗休(MGa1)的制备和纯化 将G，免疫Balb/c小鼠用杂交瘤技术制备抗G,单克隆抗体，此单抗属小鼠IgG,A类RI 用饱和硫酸按沉淀纯经Balb/c小鼠腹水中MGr;单抗. 2.2MG-rProteinA-SepharoseFF柱的制备 参照Sisson等人n，的方法，并作较大改进。取纯化的MG,，单抗与rProteinA-Sepharose FF(Pharmacia公司)在室温下偶联Ih，加交联剂反应2次，经。.1mol/LTris-HCI(pH8.0) 缓冲液封闭后装柱，用0.1moULgly-HCI(pH3.0)和。.1moUL硼酸盐缓冲液交替清洗凝胶 3次，最后用平衡缓冲液(0.05mo/lLTris-HCI,0.1mol几NaCl,pH7.8)平衡后备用。 2.3G,包涵体的处理 G，包涵体经3.0mol/L尿素洗涤3次后在0moUL尿素变性缓冲液中溶解，再在谷 肤甘肚缓冲液体系中复性Q[复性蛋白溶液用聚乙二醇浓缩，在平衡缓冲液中透析过夜， 加入凝血酶消化。 2.4G,的纯化 G,样品溶液(蛋白质量浓度为1.46泌)以2.0mL/h流速上MG31-rProteinA-Sepharose FF柱，先用平衡缓冲液洗去杂蛋白，再用50%乙二醇溶液(pH11.0)洗脱结合的03，收集 蛋白峰，对PBS缓冲液透析后检测G,的纯度及活性。 2.5。。的生物学活性测定 采用粒一单系祖细胞体外琼脂培养法131 2.6G,的纯度分析 用SDS法。 3 结果 3.1MG3,-rProteinA-SepharoseFF制备的检测 取纯化的19.46mgMG,，单 表1偶联反应的结合率 抗与2.0mLrProteinA-Sepharose 体积 蛋白质量浓度 总蛋白世 结合率 FF进行偶联反应。用二甲基庚 (mL) 二酸亚胺脂 ·二盐酸化物作交联 纯化抗体溶液 4.0 偶联后清洗溶液 20.0 40_..8137 192..466 剂，将 MG单抗共价交联于 rProteinA-SepharoseFF上，结合率约为86.6%，见表I. 3.2G:的纯化及鉴定 单抗亲和色谱柱(MG3,-rProteinA-SepharoseFF)纯化G3的结果为:上样量2.92mg. 回收量0.44mg，回收率 15.1%，其洗脱曲线见图1。得到了在电泳图上呈单一谱带的纯 化G3，分子量约为31OOOD，与对照MG3,-CNBr-Sepharose4B柱的结果一致，见图2. 辞澎94Okd QS 67A d 43.Okd