gsh1的克隆及在巴斯德毕赤氏酵母中的表达研究.pdfVIP

发酵工程学科的进展 ——第四欢全国发酵工程学术讨论套静文枭 1的克隆及在巴斯德毕赤氏酵母中的表达 gsh 艾丽静“2，饶志明1，沈微1，方慧英1，诸葛健1 (1．江南大学工业微生物中心和工业生物技术教育部重点实验奎，扛苏无锝214036 厶齐鲁和药有限公司，山东济南250100) 摘要：利用PCR技术克隆了来源干Sacd．zromyces 胱氨醺合成酶(7-gIutamyl—cysteJnesynthas)编码基固gsh1，连接多持贝表达载体pGAPZA， 转化Pichla x-33，构建了重组曹Pichia pastoris pastoris Zeocin平板上饰选多持贝阳性转化子，并采用PCR的方法进行验证。对阳性转化子的T— glutamyl—cysteine 是宿主曹的1．6倍。 关键词：gsh1f巴斯德毕赤氏酵母，酵母表达IPCRI鉴定 康，在临床医药、食品工业、及有关生物研究领域都有着广泛的应用前景[1]。GSH是由 卜谷氨酸、L．半胱氨酸和甘氨酸在ATP的存在下，经过r谷氨酰半胱氨酸合成酶(GsH I)和谷胱甘肽合成酶(GSHⅡ)催化而合成的o】。 r谷氨酰半胱氨酸合成酶是GSH合成途径中的限速酶o～。国内对编码r谷氨酰 1在大肠杆菌、酿酒酵母中的表达的研究已有报道D“]，但尚 半胱氨酸合成酶的基因gsh 1基因在巴斯德毕赤氏酵母表达。毕赤氏酵母Pichia 未见报道gsh pastgris是近些年发 展起来的一个高效表达系统，具有表达量商、糖基化程度及形式更接近于哺乳动物细胞、 易于实现高密度发酵等优点”]。本文克隆了编码rL．谷氨酰一L_半胱氨酸合成酶的基因 x-33 gsh1，连接多拷贝表达载体pGApZ-A。转化毕赤酵母，构建重组菌Pichia pastoris 酶启动子)啪。使用PGAP在发酵时不需甲醇诱导，操作工艺简单，编码7一谷氨酰半胱 氨酸台成酶的基因gsh1在巴斯德毕赤氏酵母为利用重组苗生产GSH提供了新途径。 1 材料与方法 1．1材料 1．1．1菌种与质粒 基金硬目：国家自然科学基金资助项目，扛南大学工业生物技术教育部重点实验室开放课 题(KLIB-KF-200507)。 第四次垒国发酵工程学术讨论会 cerevisiae)ALJ036、E．coli 酿酒酵母(Saccharomyces 室保藏，毕赤氏酵母(Pichia 司。 1．1．2工具酶和试剂 DNA限制性内切酶、T4DNA Ligase、Taq、PCR Ra公司DNA纯化及片段回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒为博大泰克公司产品； Yeast Oxoid ， Extract、Polypeptone购自England 操作手册。其他试剂均为国产分析纯。 1．1．3引物合成 引物Pz，B根据Genbank公布的酿酒酵母gsh l基因序列设计引物，由上海赛百盛 生物有限公司合成。P1 P2 引物两端引入X^oI和NotI位点。 PCR验证引物由Invitrogen公司设计提供： pGAP 1．2方法 1．2．1gsh1基因的扩增与鉴定 2止，引物2pL，dNTPs2,uL，Taq